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目的:FAM212B全称（Family with sequence similarity 212,member B）为蛋白序列相似性212成员B家族,同时又叫做INKA2（Inka box actin regulator 2）以及C1orf183（Chromosome 1 open reading frame 183）,截至目前FAM212B已在黑色素瘤研究中明确作为基因Fra-2/AP-1的下游靶点[1]。然而,我们对FAM212B的下游信号通路尚不清楚,在非小细胞肺癌中的表达情况和具体分子机制也依然不清楚。研究方法:1.首先,我们通过免疫组化对NSCLC标本中的FAM212B的表达和亚细胞定位进行了染色分析,同时利用统计学分析对FAM212B与非小细胞肺癌的临床病理因素等进行解析。我们应用Western blotting检测了FAM212B在HBE及6种常用的NSCLC系中的表达情况和采用激光共聚焦实验检测FAM212B在NSCLC中的定位情况。2.之后,我们应用G418筛选技术构建稳定表达FAM212B细胞系,以及运用si RNA技术,二者双向调控FAM212B表达水平,通过检测细胞活力实验和细胞体外侵袭迁移实验检测FAM212B在NSCLC中增殖侵袭能力。3.我们通过荧光素酶报告基因实验和蛋白印迹实验来研究FAM212B是否经激活经典Wnt信号通路活性发挥其分子机制作用,并进一步筛选和确定FAM212B是通过ERK信号通路发挥作用。4.同时,我们使用免疫共沉淀方法和免疫荧光实验来探究FAM212B与DVLs的结合情况。此外,我们依据FAM212B的结构域和C端含有VWV序列这一研究特点,构建敲除C端的剪切体和未敲除C端剪切体,并通过Western blotting和体外增殖侵袭实验来进一步确定FAM212B是否依赖于与DVLs的结合后进而对下游的改变。5.此时,我们思考FAM212B结合DVLs后是如何影响ERK信号通路活性的,因此我们推测FAM212B结合DVLs后通过活化小GTP酶Rac1,三者间相互结合后形成复合物进而激活ERK信号通路。同时,我们通过构建Rac1强制性失活突变体,观察FAM212B使Rho-GTPase活性的改变后下游影响因子的变化以及生物功能学变化,同时应用Rac1特异性抑制剂EHop-016来抑制Rac1/ERK信号通路的激活,二者更加证实FAM212B通过与DVLs的结合进而激活Rac1/ERK信号通路这一假说。结果:1.首先,我们发现FAM212B在正常支气管上皮组织和肺泡上皮组织呈阴性表达,在鳞癌组织和腺癌组织中的胞浆中明显呈高表达,其表达与非小细胞肺癌的TNM分期、淋巴结转移和不良预后密切相关。同时,我们发现FAM212B在非小细胞肺癌细胞系中的表达同样明显高于正常支气管上皮细胞系,并也定位于细胞浆中。2.在过表达FAM212B后,NSCLC的增殖和侵袭能力都明显增加;同时,在干扰FAM212B表达后其结果明显相反。以上结果均提示FAM212B在非小细胞肺癌中发挥一个促癌作用。3.双向调控FAM212B的表达后,经典Wnt信号通路活性没有明显的改变;双向表达FAM212B后,经典Wnt靶基因MMP-7,C-myc,Cyclin D1的表达也没有明显改变,此时研究说明FAM212B并不通过影响Wnt信号通路来发挥分子机制作用。此后,我们详细筛选增殖相关的信号通路:ERK/JNK/SPAK/p38等,我们发现FAM212B能够激活ERK信号通路。4.免疫共沉淀实验提示我们FAM212B能够和DVLs结合;同时,激光共聚焦实验显示FAM212B与DVLs共定位于细胞浆中。我们将质粒包含FAM212B全长的称为FAM212B-Wild Type,敲除C端VWV序列结构的称为FAM212B-ΔC,仅敲除INKA2结构的称为FAM212B-ΔF,转染表达后发现敲除C端VWV序列后p-ERK的表达下调,表明FAM212B蛋白分子的C端VWV序列对调控ERK信号通路起到关键作用。此外,我们发现共转染FAM212B野生型&DVLs后p-ERK表达明显增高;共转染FAM212B-ΔC&DVLs后p-ERK表达量相较下降;功能学也同样证明共转染FAM212B&DVLs后增殖和侵袭能力相较更为增加,以上说明FAM212B依赖于与DVLs的结合进而激活ERK信号通路。5.,我们通过the small GTPases实验检测FAM212B是否影响Rac1活性。过表达FAM212B后发现RAC1-GTPr S明显上调,证明FAM212B能够激活Rac1活性。因此,我们推测FAM212B与DVLs结合后通过使Rho-GTPase活化增强进而激活ERK信号通路。同时,我们通过免疫共沉淀实验发现FAM212B、DVLs和Rac1三者相互结合;激光共聚焦提示我们FAM212B与Rac1共定位与胞浆,DVLs与Rac1也主要共定位于胞浆。最后,我们使用Rac1特异性抑制剂EHop-016和转染Rac1强制失活突变体,抑制Rac1信号通路的活性后,发现p-ERK表达均明显下调,增殖和侵袭能力均明显下降。结论:FAM212B蛋白通过与DVLs结合,使Rac1活化,进而激活ERK信号通路,促进非小细胞肺癌的发生发展。