背景：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老年痴呆中所占比例最高的一种神经退行性疾病,患者会表现出进行性记忆障碍、认知障碍、日常生活能力下降等临床症状。阿尔茨海默病在老年人中发病比较普遍。流行病学研究发现,65岁以上的老年痴呆的患病率在5%左右,并且老年痴呆的发病与年龄成正比,在高龄人群中发病率较高。随着我国人口老龄化的逐年加剧,老年痴呆的患病率增加,如何有效治愈老年痴呆成为医学界乃至整个社会关注的问题。AD患者的脑部呈现出神经元缺失以及皮质海马萎缩,典型的病理特征主要是大脑及海马区的p淀粉样蛋白(amyloid β peptide, Aβ)在细胞外积累并形成老年斑(senile plaque, SP)、脑神经细胞内Tau蛋白异常聚集、出现由成对螺旋丝(paired helical filaments, PHF)构成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangle,NFT),以及神经元的缺失等。研究发现,神经元的缺失与患者表现出的认知记忆能力的下降密切相关。然而在AD患者的发病前期或者是在脑部出现老年斑的患者中并没有检测到神经元的缺失。神经元缺失的机制尚未得到完整的解释,而越来越多的证据显示细胞凋亡有可能是导致神经元缺失的原因。West等研究发现了神经元的缺失与病理性的Tau密切相关。在AD发病机制的研究中,病理性的Tau蛋白P301L位点突变能模拟AD患者脑部的NFT的出现以及神经元的缺失,因而被广泛研究。嘌呤霉素敏感的氨肽酶(Puromycin-Sensitive Aminopeptidase, PSA)是分子量为110kD的高度保守的N-末端氨肽酶,属于M1金属肽酶家族,主要以胞浆蛋白的形式存在于大脑。PSA在神经系统中具有重要功能,PSA因其氨肽酶的活性能够降解具有聚集性质的蛋白质,像亨廷顿病中的Poly-Q,同时还降解其他神经退行性疾病中的沉积蛋白如exon-1, ataxin-3, mutant a-synuclein and SOD1。 Karsten等发现：在体内PSA可以抑制病理性Tau引起的神经退行性病变,当PSA失去作用后,这种神经病变会加重；在体外,PSA可以直接降解病变的Tau。Kudo等研究发现与TauP301L转基因鼠相比,hPSA-Taup301L双转基因小鼠运动神经元数量增多,神经胶质过多症消失,在脊髓、脑干、皮质、海马、小脑等部位病理性的Tau形成的神经纤维缠结减少。因此提出了增加PSA以作为治疗Tau蛋白引起病变的设想,但具体的机制尚未明确。实验目的：研究嘌呤霉素敏感的氨肽酶对于TauP301L诱导的细胞凋亡的影响。实验方法：1.构建TauP301L表达载体并将其转染入SH-SY5Y细胞和PC12细胞；2.用MTT法检测SH-SY5Y细胞和PC12细胞分别在转染pcDNA3.1空质粒和TauP301L24h、48h和72h后的细胞存活率；3.按照2中提到的方法处理细胞,用Hochst33342染色法检测细胞的细胞核的形态学变化；4.把PC12细胞分成四组,分别为：pcDNA3.1组、TauP301L组、PSA组、PSA+TauP301L组,以便于检测过表达PSA对细胞的影响；将SH-SY5Y细胞分成五组,分别为：pcDNA3.1组、TauP301L组、对照小RNA组、PSA-siRNA组、PSA-siRNA+TauP301L组,以便于检测当干扰掉PSA后对细胞的影响。对以上处理的各组细胞,同时用Western blotting法检测Caspase-3蛋白的表达,酶标仪检测Caspase-3的活性变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验结果：1. TauP301L对细胞增殖率的影响具有时间依赖性,当细胞转染48h后,与pcDNA3.1组相比,TauP301L组能显著抑制细胞增殖率(P<0.01)；2. TauP301L转染细胞48h后,细胞核明显出现凋亡的形态学变化；3.与pcDNA3.1组相比,细胞中转入TauP301L后,细胞中Caspase-3的活性升高(P<0.01),活性形式表达量增加(P<0.01),细胞凋亡率增加(P<0.01),在PC12细胞中过表达PSA,可以使TauP301L诱导的Caspase-3的活性形式表达量和活性明显下降(P<0.01),细胞凋亡率显著下降(P<0.01)；而在SH-SY5Y细胞中干扰PSA表达后,TauP301L诱导的细胞凋亡率显著升高,Caspase-3的活性形式表达量和活性均升高(P<0.01)。结论：TauP301L转入SH-SY5Y细胞和PC12细胞后均能诱导细胞凋亡；在PC12细胞中过表达PSA能够下调TauP301L所诱导的细胞凋亡；在SH-SY5Y细胞中干扰PSA表达对TauP301L所诱导的细胞凋亡起促进作用。可见PSA能构抑制细胞凋亡,对神经细胞起到保护作用。