牡丹皮多糖的结构表征、抗炎活性评价及其与大豆分离蛋白互作规律研究

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牡丹皮,又称丹皮,是毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮,广泛应用于中药名方。现代药理学研究表明,牡丹皮具有调节血糖、缓解糖尿病并发症、抗炎等多种药理作用。多糖作为一种水溶性大分子,其在传统中药水煎液中占据很大的比例。研究报道,多糖具有多种生物活性,如免疫调节作用、调节肠道菌群、抗炎、抗肿瘤、抗氧化应激等。多糖也是牡丹皮的主要活性成分之一,目前对于牡丹皮多糖的活性研究主要集中在降血糖活性,对其初级结构表征不够完善,且其抗炎、调节肠道菌群以及与食物组分相互作用的研究鲜见报道,有鉴于此,本文对牡丹皮多糖(MCP)进行分离纯化和结构鉴定,研究MCP在体外模拟消化与酵解,以LPS诱导RAW264.7炎症模型来评价牡丹皮多糖的抗炎活性,并考察其与大豆分离蛋白(SPI)相互作用的机制和复合物的性能,为牡丹皮多糖的开发和利用提供理论基础。主要研究内容与成果如下:(1)通过水提醇沉得到牡丹皮粗多糖,经过脱色、脱蛋白等处理,使用DEAE-52离子交换层析色谱柱分离纯化,得到MCPs、MCP-2和MCP-5三个组分,其中对MCPs进一步超滤离心纯化得到MCP,并确定为主要的研究对象。平均相对分子量测定结果表明:MCP的分子量分布均一,其重均平均分子量为86.74 k Da,是由葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)和阿拉伯糖(Ara)组成的杂多糖,其含量摩尔比为1.0:2.5:7.7。经过红外、甲基化和NMR分析结果表明:MCP由T-Araf-(1→、→5)-Araf-(1→、→3,5)-Araf-(1→、→3,4)-Glcp-(1→和→4)-Galp-(1→五种糖苷键组成,主链是以→5)-Araf-(1→与→3,4)-Glcp-(1→和→4)-Galp-(1→叉链接组成的,侧链是T-Araf连接在→3,5)-Araf-(1→和→3,4)-Glcp-(1→的3号位上。此外,MCP有良好的热稳定性,表面呈现不规则的片状,疏松的多孔结构。(2)通过体外模拟消化,发现经口腔、胃部和小肠体外模拟消化时牡丹皮多糖MCP的分子量和还原糖没有显著性变化,这说明MCP不能被上消化道(口腔、胃和小肠)消化吸收。经过体外模拟发酵24 h后,MCP组的SCFAs总含量显著高于空白对照组;同时肠道菌群组成结果显示MCP可以促进有益菌属大单胞菌属Megamonas、Bacteroides、Prevotella和Bifidobacterium等的生长,同时降低有害菌大肠埃氏菌属-志贺氏菌属Escherichia-Shigella的丰度。说明MCP有利于粪便中的某些微生物的代谢,促进SCFAs的产生,同时MCP可能通过调节肠道菌群,提高机体的抗炎和免疫调节能力,是一种潜在的益生元。(3)建立LPS刺激的RAW 264.7小鼠巨噬细胞的炎症模型,探究牡丹皮多糖MCP的抗炎活性及其潜在的抗炎机制。研究表明,牡丹皮多糖在合适的浓度范围内(100~1600μg/m L)对小鼠巨噬细胞的生长起到促进作用,MCP可以通过抑制NO和四种炎症因子(TNF-α,IL-6,IL-1β和INF-γ)在细胞内的产生以及相关m RNA的表达来达到抗炎的作用,抑制作用呈现浓度依赖性,且在800μg/m L时抑制作用最强。Western Blot结果显示MCP可以通过下调MAPK和NF-κB两个信号通路中的相关蛋白(如p-p38、pERK、p-JNK、STAT3、PI3K、C-Jun、p-p65、IκBα/β和p-IκBα/β)表达,从而发挥良好的抗炎优势,这也为MCP之后在功能性食品和膳食补充剂产品中的应用提供更深的理论依据。(4)将牡丹皮多糖应用到包含大豆分离蛋白基的模拟食品体系中,研究其抗炎活性变化规律,同时研究了p H 7.0条件下,MCP溶液(1%)与(SPI)溶液(10%)的相互作用机制及对多糖和蛋白性能的影响。通过紫外、红外、荧光、粒径和电位等研究发现,MCP与SPI白之间可能存在氢键和范德华力,MCP和SPI相互作用会提升SPI的溶解度,同时MCP-SPI复合物具有良好的抗炎活性,为拓宽其作为功能性食品成分的应用范围提供理论依据。
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