论文部分内容阅读
核不均一核糖核蛋白k (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein k, Hnrnpk)是一个多功能蛋白,参与DNA修复、转录和翻译调控、RNA的剪切加工等生物学过程,能通过多种途径对成肌细胞增殖与分化起重要调控作用,但其作用机制及信号通路尚不清楚。c-Src作为非受体蛋白酪氨酸激酶家族的一员,可以通过Rat/MEK/ERK和p38MAPK信号通路对骨骼肌肌生成过程起着重要的调节作用,但其在成肌细胞中的表达调控机制却不清楚。以往研究表明Hnrnpk与c-Src存在多层次的互作并发挥重要生物学功能。本研究从猪Hnrnpk和c-Src基因的克隆及表达着手,以小鼠C2C12成肌细胞为模型,结合qRT-PCR、免疫印迹、细胞转染、亚细胞定位、免疫荧光、过表达、RNA干涉、Co-IP、GST pull-down、酵母双杂交、RIP等方法,深入探讨Hnrnpk与c-Src的互作及其在C2C12成肌细胞增殖分化中的作用,这将为阐明骨骼肌发育和再生的复杂网络调节机制奠定基础,而且还可望为畜牧业提高动物的产肉量、肉品质及医学上控制肌肉再生提供理论依据。本研究得到以下结果：1. Hnrnpk基因的克隆及时空表达分析克隆得到2056bp猪Hnrnpk基因的cDNA序列,包含1395bp的开放阅读框,编码464个氨基酸；Hnrnpk基因在梅山猪不同发育时期的背最长肌中均差异表达,胚胎期表达量最高,并且随着生长发育呈下调表达。Hnrnpk基因在120日龄的大白猪肌肉和脂肪组织中相对高表达,肾、肺中次之,心、大脑、肝、脾和卵巢中的表达相对较低。而就四种不同类型肌肉组织而言,半腱肌和背最长肌中表达量最高,咬肌次之,股二头肌中最低；Hnrnpk基因在C2C12细胞分化过程中表达下调,其直接调控的c-myc、c-Src、p21等基因表达趋势与之相似。2. c-Src基因的克隆及时空表达分析克隆得到4126bp猪c-Src基因的cDNA序列,包含1629bp的开放阅读框,编码542个氨基酸；c-Src基因在大白猪和梅山猪肌肉中的表达模式相似,均在胚胎65日龄高表达,出生后3天表达量极显著减少,而在21日龄又表达上调,此后随着发育逐渐下调；两品种相比,胚胎65日龄,c-Src基因在梅山猪中的表达量显著高于大白猪(P<0.05),而出生后3天、21天及6月龄大白猪中的表达量均极显著高于梅山猪(P<0.01); c-Src基因在猪不同组织中广泛表达,在PT期,大脑中c-Src基因的表达量最高,肝脏中表达量最低。在3天,肝脏中c-Src基因的表达量最高,骨骼肌中表达量最低。在4月龄,肺中c-Src基因的表达量最高,骨骼肌中表达量最低；在C2C12细胞诱导分化过程中,c-Src基因随着诱导分化表达先上调后逐渐下调。3. Hnrnpk对C2C12细胞增殖分化的影响超表达Hnrnpk基因后,成肌转录因子MyoG, Myf6的表达量下调,而MyoD却上调,成熟骨骼肌相关分子标记物MLC2、MCK、TAK1下调,c-Src表达量上调,p21下调；siRNA干涉Hnrnpk后,成肌转录因子MyoG、Myf6和MyoD以及成熟骨骼肌相关分子标记物MLC2、 MCK表达量上调,c-Src表达量下调,p21上调。表明Hnrnpk可能通过上调c-Src和下调成肌转录因子MRFs家族的表达从而促进C2C12细胞增殖或抑制分化。4. c-Src对C2C12细胞增殖分化的影响超表达c-Src基因后,成肌转录因子MyoG、 Myf6、 MyoD的表达量下调,而且成熟骨骼肌相关分子标记物MLC2、 MCK、 TAK1表达量下调,p21表达量下调；PP2抑制剂处理C2C12细胞后,MyoG和MyoD分化标记基因、p21、凋亡基因Caspase3表达量均上调,p53和c-myc基因下调表达,而c-Src表达没有变化。表明c-Src对C2C12细胞增殖分化发挥作用可能是通过直接或间接调节成肌转录因子MRFs家族和p21的表达来实现的。5.Hnrnpk与c-Src的互作分析通过ELM在线分析发现与Hnrnpk相互作用的众多元件包括了c-Src蛋白的SH3结构域,进而采用Co-IP初步证实内源性的Hnrnpk和c-Src在分化的C2C12细胞中相互作用；此外,又用酵母双杂交和GST pull-down方法对Hnrnpk与c-Src的互作进一步分析,酵母双杂交结果表明Hnrnpk与c-Src的全长以及单独的SH3结构域互作,与其他缺失体不互作,与c-Src全长的结合活性要强于单独的SH3结构域；GST pull-down结果表明Hnrnpk能够在体外与c-Src的全长及所有缺失体相互作用。RIP实验结果表明分化的C2C12细胞中c-Src mRNA与Hnrnpk的结合能力要极显著高于阴性对照IgG抗体(P<0.01),而增殖的C2C12细胞中c-Src mRNA和Hnrnpk的结合能力与阴性对照IgG抗体相比差异不显著(P>0.05),表明Hnrnpk只在分化的C2C12细胞中与c-Src mRNA互作,这与鼠Hnrnpk在C2C12细胞中的亚细胞分布是一致的。