花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)属芸香科植物,在中国被广泛种植。其突出特点是浓郁的香气。产生这种香气的主要成分是挥发性萜类化合物。香气作为花椒最重要的特征之一,也是评价其品质的重要指标,然而关于花椒香气的分子合成机制方面还处于研究空白阶段。在本研究中,选用韩城大红袍花椒和府谷花椒的不同发育时期果实为研究材料,在KEGG数据库中挑选出植物萜类代谢通路上的16个关键基因进行引物设计。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)、基因克隆、烟草瞬时表达、原核表达体外酶活检测,RT-qPCR和生物信息学等技术来开展研究。主要研究结果如下:1.GC-MS结果显不:两个花椒品种的挥发性萜类化合物变化趋势是一致的。随着果实成熟,萜类化合物逐渐积累,至第三个时期(发育中期)达到峰值,随后逐渐减少。含量最多的萜类是单萜,其中α-pinene含量最高,在韩城大红袍和府谷花椒的含量中分别为24.74%和20.78%。总的来说,韩城大红袍中挥发性萜类物质含量占62%,府谷花椒占41%。2.RT-qPCR对挑选的通路基因进行表达谱的检测,发现大部分基因表达上调。其中ZbDXS自身的相对表达量最高,是MEP途径上关键的限速酶,MEP途径上的基因高表达相对于MVA途径,表明花椒萜类代谢可能以MEP途径为主。3.依据上述结果,对MEP途径上游关键限速酶,1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)和MVA途径下游关键限速酶,法呢基焦磷酸合酶(FPS)进行功能分析。基于先前的转录组数据,成功从花椒中克隆出ZbDXS和ZbFPS的CDS序列,长度分别为2172 bp和1029 bp,编码724个和343个氨基酸。4.生信分析表明,ZbDXS属于亲水性蛋白,没有信号肽及跨膜结构域,亚细胞定位预测其定位于线粒体上。系统发育树分析显示ZbDXS与多种植物的DXS2家族成员聚集在一个大分支上,在此分支内部又与柑橘DXS2高度聚集在一小分支中,推测该基因序列具有DXS2类型基因的功能,参与花椒萜类化合物的代谢过程;ZbFPS属于稳定蛋白及亲水性蛋白,不含信号肽和跨膜结构域,系统发育树分析显示ZbFPS与辣椒、番茄、马铃薯和柑橘亲缘关系最近,聚集在一个大的分支,支持率为100%,并且与其中的柑橘属植物高度聚集在一小分支,这与植物系统发育的亲缘关系相一致。5.体外酶活实验结果显示:纯化蛋白ZbDXS,ZbFPS都具有DXS酶和FPS酶的功能。分别瞬时表达ZbDXS和ZbFPS于本式烟草叶片中,发现都使烟草的萜类含量增加。通过RT-qPCR对两个基因表达模式研究发现,其均在花椒不同组织中稳定表达。ZbDXS和ZbFPS均在果实中的相对表达量最高,其中ZbDXS在根中的相对表达量最低,ZbFPS在茎中的相对表达量最低。