论文部分内容阅读
目的:人胰腺癌是临床常见高度恶性肿瘤之一,近年来发病率呈上升趋势,手术可切除率在10%左右,以手术为主的综合治疗手段效果不好,术后转移早,其中位生存时间不足5个月,五年生存率小于5%;而在不可切除的病例中,化疗和放疗副反应大。因此,提高治疗效果,探索胰腺癌的基因治疗有重要意义”然而基因治疗的疗效并不令人满意,原因是多方面的,其中转移基因在靶细胞组织或器官中表达的时空特异性、基因治疗载体的安全性等问题严重影响了此项工作的进展。端粒酶是一个核糖蛋白复合体,它的功能是给染色体末端加入重复序列(TTAGGG)n,众所周知,它在细胞永生化中发挥着重要作用。端粒酶在很多肿瘤细胞中呈现阳性,而在正常细胞端粒酶则呈阴性。在端粒酶3个必需组成部分中,端粒酶催化亚单位(telomerase catalytic subunit,hTERT)只在肿瘤细胞中表达,利用hTERT启动子调控目的基因靶向表达有望成为靶向基因治疗的重要手段。铜绿假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin A,PE)是由铜绿假单胞菌分泌,分子量约为66 000的一条单链多肽,由613个氨基酸组成,其毒性强烈。PE作为新型的导向性药物-免疫毒素(Immunotoxins,ITs)的毒素分子在生物治疗中显示了其良好的杀伤效果。PE38KDEL是截短了的PE,其分子量较PE小,免疫原性较PE低,其毒性较较PE提高了6-10倍。以PE38KDEL毒素为”导弹”,以人端粒酶逆转录酶(Human TelomeraseReverse Transcriptase,hTERT)启动子为肿瘤靶向启动子,构建真核表达载体phTERTp-PE38KEDL-IRES2-EGFP,使EGFP和PE38KDEL在具有端粒酶活性的人胰腺癌细胞MiaPaCa2中特异性表达。方法:从含hTERT启动子序列的重组质粒pGL3-hTERTp上,PCR得到约280 bp的核心启动子片段,以之取代pIRES2-EGFP中的CMV启动子,然后将PE38KDEL亚克隆到pHTERT-IRES2-EGFP的多克隆位点(MCS)中,构建phTERTp-PE38KEDL-IRES2-EGFP真核表达载体。用含有巨细胞病毒(CMV)启动子的质粒pIRES2-EGFP作为阳性对照,脂质体转染法分别转染人胰腺癌细胞MiaPaCa2,人胚肺成纤维细胞Wi-38,荧光显微镜下观察各细胞中EGFP转录表达情况。结果:双酶切及测序均证实真核表达载体phTERTp-PE38KEDL-IRES2-EGFP构建成功。细胞转染结果显示:在转染了pIERS2-EGFP质粒的MiaPaCa2、Wi-38、细胞中EGFP都有不同程度的表达;转染phTERTp-PE38KEDL-IRES2-EGFP质粒的MiaPaCa2人胰腺癌细胞中可清晰地观察到EGFP强荧光表达,而Wi-38细胞中无荧光表达。结论:hTERT启动子能调控PE38KDEL及EGFP在胰腺癌细胞特异性表达。CMV启动子调控的EGFP在胰腺癌细胞和正常细胞中的表达不具有特异性。hTERT启动子有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的调控元件。