由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的马铃薯晚疫病是世界范围内普遍发生的一种马铃薯病害，给全球马铃薯生产造成了巨大的经济损失。致病疫霉属于卵菌(Oomycota)，卵菌病原物能分泌多种效应分子，作用于寄主植物细胞的不同位点，可引起寄主生理变化和触发寄主的防卫反应。NPP1-like和PcF/SCR-like家族是致病疫霉中两个典型的致坏死效应分子家族，而目前对这两个家族的研究较少，其具体功能、作用靶标、如何定位等致病机理尚不清楚。因此，本研究选择致病疫霉NPP1-like家族中PiNLP9、PiNLP30及PcF/SCR-like家族中的PcF/SCR.3、PcF/SCR.13作为研究对象，对其功能进行研究，具体内容如下:　　1.候选坏死基因克隆及生物信息学分析。以致病疫霉菌株HK09-19菌丝cDNA为模板，克隆PiNLP9、PiNLP30、PcF/SCR.3、PcF/SCR.13基因并进行生物信息学分析。结果显示，PiNLP9序列大小840 bp，含有不完全保守的“GHRHDWE”序列。PiNLP30序列大小714 bp，序列中含有严格保守的“GHRHDWE”序列，前19个氨基酸为信号肽，PiNLP9和PiNLP30序列的N端均含有保守的2个半胱氨酸。PcF/SCR.3和PcF/SCR.13大小分别为213 bp、276 bp，序列中均含有信号肽序列，预测含有3个二硫键。　　2.坏死基因在植物体内的功能验证。将PiNLP9、PiNLP30、PcF/SCR.3、PcF/SCR.13连至pBI121上构建基因真核表达载体，然后转化农杆菌并在本生烟内进行瞬时表达。结果显示，NPP1-like家族中的PiNLP30编码蛋白可致本生烟叶片细胞皱缩坏死，而PiNLP9编码蛋白不具有诱导坏死活性。PcF/SCR家族中的PcF/SCR.3和PcF/SCR.13接种本生烟后均可以导致本生烟叶片细胞皱缩坏死。　　3.PiNLP30基因中潜在活性位点突变及瞬时表达分析。参照腐霉NLP基因活性位点，设计引物将PiNLP30中3个潜在活性位点进行体外突变并在本生烟中瞬时表达。结果显示H122位点突变后引起与野生型类似的皱缩坏死症状，D125位点突变后坏死症状较野生型变弱，而E127和H122/D125/E127位点突变后不能产生坏死反应，说明D125和E127位氨基酸影响蛋白的致坏死功能。　　4.PiNLP30基因表达模式分析。设计PiNLP30基因荧光定量引物，提取接种致病疫霉HK09-19游动孢子后不同时间间隔的马铃薯叶片RNA，反转录为cDNA，利用所设计的引物进行荧光定量PCR，分析PiNLP30基因在致病疫霉侵染寄主不同阶段的表达量变化。结果显示，游动孢子接种马铃薯叶片后PiNLP30出现上调表达，并且在12h出现第一个表达高峰，上调了约260倍;60～108 h出现第2个表达高峰，表达量上调约160～230倍，说明PiNLP30在病原菌的致病过程中发挥一定作用。　　5.PiNLP9、PiNLP30基因原核表达分析。构建PiNLP9、PiNLP30基因原核表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达。结果显示，pET28b-PiNLP9、pET28b-PiNLP30经0.6 mmol·L-1 IPTG于37℃下诱导6h后表达了分子量为32KD、27 KD的目的蛋白，蛋白主要以包涵体形式存在。利用镍琼脂糖亲和层析对PiNLP30蛋白进行纯化，获得了纯化蛋白。