【摘 要】
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[目 的]地舒单抗是治疗骨巨细胞瘤（giant cell tumor of bone,GCTB）唯一的靶向药物,其详细作用机制并未完全明确。前期研究发现p62蛋白在GCTB组织中高表达,下调p62蛋白表达能够抑制GCTB单核基质细胞增殖及侵袭,可能与地舒单抗疗效相关。本研究通过检测地舒单抗治疗GCTB前后p62蛋白表达变化,分析p62蛋白与地舒单抗疗效的相关性,初步探讨p62蛋白在地舒单抗治疗GC
【基金项目】
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国家自然科学基金（81302343）；
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[目 的]地舒单抗是治疗骨巨细胞瘤（giant cell tumor of bone,GCTB）唯一的靶向药物,其详细作用机制并未完全明确。前期研究发现p62蛋白在GCTB组织中高表达,下调p62蛋白表达能够抑制GCTB单核基质细胞增殖及侵袭,可能与地舒单抗疗效相关。本研究通过检测地舒单抗治疗GCTB前后p62蛋白表达变化,分析p62蛋白与地舒单抗疗效的相关性,初步探讨p62蛋白在地舒单抗治疗GCTB中发挥的作用及可能机制。[方法]1.收集地舒单抗治疗前后配对GCTB新鲜组织标本6对,采用RT-qPCR、Western Blot检测p62 mRNA及蛋白;采用ELISA检测9对配对血清中p62蛋白,比较地舒单抗治疗GCTB前后,p62表达是否发生变化。2.收集地舒单抗治疗GCTB前后石蜡标本40例,采用IHC检测p62蛋白,分析p62蛋白表达水平与GCTB临床Campanacci分级、病理性骨折、复发等临床特征的相关性。3.分别留取GCTB新鲜组织（T）及转移的GCTB新鲜组织（M）,进行原代细胞培养,分离并鉴定出单核基质细胞（T株和M株）;采用慢病毒质粒转染,获得p62低表达并稳定传代的单核基质细胞,使用地舒单抗处理并分组,包括:GCTB control组;shp62组:p62表达下调的单核基质细胞;shp62-Denosumab组:地舒单抗处理p62表达下调的单核基质细胞;NC组:shp62阴性对照细胞;NC-Denosumab组:地舒单抗处理shp62对照细胞。4、地舒单抗处理不同组单核基质细胞,采用Western Blot及免疫荧光检测p62蛋白变化;采用CCK8检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞周期及凋亡、Transwell检测细胞迁移及侵袭能力变化,观察地舒单抗对不同p62蛋白表达水平单核基质细胞的抑制作用。[结 果]1.新鲜GCTB组织标本中,地舒单抗治疗后p62 mRNA及蛋白表达较治疗前下降,统计学差异显著（均P<0.05）;血清标本中,地舒单抗治疗前后p62蛋白表达未见差异（P>0.05）。2.GCTB石蜡标本中,地舒单抗治疗后p62蛋白表达水平较治疗前下降,差异具有统计学意义（P<0.05）;下降水平同GCTB临床Cammpanacci分级、病理性骨折无相关性（均P>0.05）;与肿瘤复发负相关（P<0.05）。3.从1例股骨下段GCTB肿瘤组织（T株）及1例肱骨上段GCTB肩胛骨转移肿瘤组织中（M株）分离原代细胞。肿瘤组织均由破骨样多核巨细胞和单核基质细胞组成,转移组织中多核巨细胞较少;传代48小时后多核巨细胞逐渐减少,2-3代后消失,剩余细胞H3.3 G34W免疫荧光染色阳性,即为单核基质细胞,使用第四代细胞进行后续实验。慢病毒质粒转染后,获得p62低表达并稳定传代的单核基质细胞。4.采用地舒单抗800 μg/ml分别处理M株不同组单核基质细胞细,p62蛋白表达均有不同程度下降,shp62-Denosumab组单核基质细胞p62蛋白水平较对照组（NC-Denosumab组）降低,两组统计学差异明显（P<0.05）;T株、M株shp62-Denosumab组单核基质细胞增殖水平均较对照组降低,两组统计学差异明显（P<0.0001,P<0.01）;T株、M株shp62-Denosumab组单核基质细胞较对照组明显停滞于G0/G1期,两组统计学差异明显（均P<0.05）;T株、M株shp62-Denosumab组单核基质细胞凋亡比率分别为27.730%、45.960%,高于对照组15.399%、39.750%,两组统计学差异明显（P<0.01,P<0.05）;T株、M株shp62-Denosumab组单核基质细胞迁移数分别为30.330±0.881及61.000±7.550,低于对照组111.000±3.055及148.000±4.619,两组统计学差异明显（P<0.0001,P<0.001）;T 株、M 株 shp62-Denosumab 组单核基质细胞侵袭数分别为 51.000±1.528 及 58.670±2.603,低于对照组 73.330±1.856 及 97.670±5.548,两组统计学差异明显（P<0.001,P<0.05）。[结 论]1.地舒单抗治疗GCTB后,p62蛋白表达下调,可能与地舒单抗疗效相关;2.地舒单抗通过下调p62蛋白表达,抑制单核基质细胞增殖及迁移侵袭能力;3.下调p62蛋白表达后,地舒单抗通过诱导单核基质细胞凋亡,进一步抑制细胞增殖及迁移侵袭。
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