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马氏珠母贝[Pinctadamartensii(Dunker)],又称合浦珠母贝,是培育海水珍珠的主要贝类,已成为广东、广西和海南等沿海部分地区的支柱产业。马氏珠母贝养殖业一直受到多毛类寄生病--凿贝才女虫(Polydoraciliata)的危害,这种多毛类寄生病极大地影响了海水珍珠产量和质量,严重地制约着我国珍珠养殖业的健康发展。因此,本研究通过抗病基因的筛选,为防治多毛类寄生虫病提供了一种新方法。
本文以感病和健康马氏珠母贝的mRNA为实验材料,构建了马氏珠母贝感病SMARTcDNA血液文库1097个克隆,健康SMARTcDNA血液文库1254个克隆。将地高辛标记的总RNA为探针,筛选文库的克隆,共得到416个阳性克隆。按照显色光密度相差5倍的原则,在阳性克隆中共挑选差异克隆66个,其中感病的马氏珠母贝血液文库中呈阳性的克隆有33个,健康马氏珠母贝血液文库中呈阳性的克隆也有33个。
将挑选的66个差异克隆测序,得到58个测序结果,有8个测序失败。将测序获得的序列在NCBI上进行在线序列分析(去除载体序列、BLASTx、BLASTn、ORF、查找与数据库中其它物种已知序列的同源性、搜索开放阅读框、推断可能的氨基酸序列),并用CLustalX1.8软件进行序列比对。结果显示它们分别与29个已知基因具有不同程度的相似性,并根据这29个的基因片段设计了26个基因特异性引物,做RT-PCR。结果发现,赖氨酸羟化酶基因、Profilin基因、细胞色素氧化酶基因、金属硫蛋白基因、检验点激酶基因、蛋白激酶基因、马氏珠母贝的核糖体基因和NCBI数据库已知序列没有同源性的未知蛋白等在马氏珠母贝肝、胃、血液、鳃、足、心脏、外套膜等组织有不同的组织表达差异,为抗病基因筛选奠定了基础。