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[目的]1、构建TSG101(tumor susceptibility gene101)的小干扰RNA (siRNA)表达载体。2、利用瞬时转染的方法,获取TSG101差异表达的胃癌细胞AGS并对其进行鉴定,为后续构建稳定转染细胞组及探讨TSG101在胃癌侵袭和转移中的作用机制奠定基础。。[方法]1、根据小干扰RNA的设计原则及参考文献,设计两条TSG101的靶序列,应用DNA重组技术分别将目的序列克隆入小干扰RNA的表达载体pGenesil-1.1中；2、采用阳离子脂质体介导的方法将TSG101小干扰RNA载体(pGenesil-1.1-TSG1011, pGenesil-1.1-TSG1012)转入高表达TSG101的胃癌细胞AGS中(TSG101-siRNA转染组,实验组),同时设置阴性对照组(阴性对照序列HK转染组)和空白对照组(未转染组)。分别选取24h及48h观察细胞,于48h收集细胞。之后利用RT-PCR、荧光定量PCR和Western blot检测实验组和对照组AGS细胞TSG101mRNA和蛋白的表达差异。[结果]1、酶切鉴定及基因测序表明：插入干扰载体pGenesil-1.1中的DNA片段大小、序列完全正确,载体构建成功；2、瞬时转染24h及48h荧光显微镜下观察：未转染组组未见绿色荧光；TSG101-si RNA转染组及阴性对照组在24h和48h均有有部分细胞呈绿色荧光阳性,各组转染率依次,24h为：35%,38%,31%；48h为：65%,69%,55%。3、RT-PCR、荧光定量PCR及Western Blot检测TSG101mRNA及TSG101蛋白：(1) RT-PCR及Western Blot:以管家基因β-actin为内参照：空白对照组及阴性对照组均表达TSG101mRNA及蛋白,TSG101siRNA转染组较对照组TSG101mRNA及蛋白的的表达明显降低。(2)荧光定量PCR示：TSG101的扩增曲线和熔解曲线可见每组样品的Ct值均具有良好的线性关系。对Ct值统计分析示：AGS-TSG1011、AGS-TSG1012与AGS-HK及AGS之间差异有统计学意义(P<0.05); AGS-TSGG1011、AGS-1012之间,AGS-HK、AGS之间均无统计学意义(P>0.05)。采用2(?)ΔΔCt方法定量分析显示各组TSG101mRNA表达：AGS-TSG1011、AGS-TSG1012较AGS-HK及AGS明显减少。(3)对WB结果灰度扫描并统计分析：AGS-TSG1011、AGS-TSG1012与AGS-HK及AGS之间差异有统计学意义(P<0.05); AGS-TSGG1011、 AGS-1012之间,AGS-HK、AGS之间均无统计学意义(P>0.05)[结论]1、成功构建肿瘤易感基因TSG101的小干扰RNA载体,并经瞬时转染成功转入胃癌细胞AGS中；2.TSG101小干扰RNA载体(pGenesil-1.1-TSG1011、pGenesil-1.1-TSG1012)体外瞬时转染人胃癌细胞AGS,可以有效的使TSG101基因在RNA水平和蛋白水平表达均明显降低,从而为进一步构建稳定转染基因TSG101的AGS细胞系及探讨TSG101在胃癌侵袭和转移中的作用机制奠定基础。