研究背景:人工肝支持系统是目前公认治疗各种急性肝功能衰竭的最有效方法,以肝细胞为基础的生物型人工肝(Bioartificial Liver,BAL)更是未来治疗各种急慢性肝病的希望所在。生物型人工肝以体外培养的具有生物活性的肝细胞为主要构成,因而具有类似肝的解毒、分泌、合成及转化等功能,其核心部分便是执行肝功能的肝细胞。随着近代细胞工程学的进展,细胞生物学、组织培养技术、生物学技术的迅猛发展,肝细胞作为构建生物人工肝的生物部分,作为细胞移植治疗急慢性肝衰竭的种子细胞以及作为药物筛选的靶细胞,成为目前研究的热点。而制备和培养高活力的肝细胞,尤其是人肝细胞的制备,正是这些研究的最基本环节。肝细胞分离方法有多种:机械分离法、鳌合法和酶消化法等。最初的机械分离法始于半个多世纪前,1956年Sorrentino第一次用机械的方法分离新鲜肝组织制成匀浆,并在体外进行药物解毒试验,但机械分离法获得的肝细胞,细胞数量少、活性差,逐渐被弃用。1967年Howard创建了胶原酶灌流法,1972年Seglen进一步将这种方法发展为两步灌流法,即首先灌注预热的无钙平衡盐溶液去除肝血窦内的血细胞及部分非实质细胞,然后再灌注含有胶原酶的平衡盐溶液,进行体外消化后,分离提纯而获得肝细胞。用此法获得的肝细胞,细胞数量和活性都得到了提高,而且减少了肝细胞悬液中的杂质。胶原酶二步灌流法已成为目前实验室分离肝细胞的常用方法。二步灌流法广泛应用于中小型动物如小鼠、大鼠、兔和犬等动物肝脏的分离。目前,人肝细胞的分离也主要应用肝移植手术中因配型不合而丢弃的供肝进行胶原酶二步灌流分离,但此方法的明显不足在于肝移植的供肝极为紧张,而因配型不合丢弃的供肝更是稀缺,完全无法满足基础研究中对人肝细胞的巨大需求,以至于大量的基础研究不得不用动物的肝细胞来代替人的肝细胞。也有很多学者应用肝叶切除的小块肝组织,通过其残存的肝脏小血管进行二步法灌流分离肝细胞,但此方法对用于分离肝细胞的肝组织块要求较高,必须具备有3～4支可供灌流的血管,但实际在手术中获取的人肝组织块大多极不规则,很难找到血管,因而无法实施二步法灌流。而且即使找到血管,通过残存的不规则血管进行灌流,灌流非常不充分,进而影响分离效果。因此,建立实用的从人肝脏分离肝细胞的细胞分离技术成为很多研究的必需。本研究在经典二步灌流法的基础上,建立针对手术切除不规则小块肝组织的多点穿刺两步灌流分离成人肝细胞的新方法,使基础研究中急需的人肝细胞的获取更为简便、容易,从而为应用人肝细胞进行生物人工肝、细胞移植等研究提供技术保障。本实验进一步对多点穿刺灌流法分离获得的原代人肝实质细胞进行体外短期培养,并间隔连续检测培养细胞上清白蛋白、尿素氮、细胞内酶的水平,还检测了培养细胞的代谢功能。从而,一方面,对多点穿刺灌流法能否分离获得具有功能活性的肝细胞进行了鉴定,另一方面,对成人原代肝细胞在体外的培养过程中,其功能活性状况的动态变化进行了分析。方法:1、人肝组织标本来源于南方医院肝胆外科肝癌、肝血管瘤患者手术切除病变的周围正常组织,约0.5～5g。2、采用本课题组建立的多点穿刺灌流法分离成人肝细胞。具体肝细胞分离步骤包括:①应用针头注射器多点穿刺灌注预热的38℃灌流液,使肝组织块由暗红色变为灰白色且流出的灌流液变清亮,灌注时压力、流速要恒定,不能有气泡。此过程大约10-15分钟。②继以38℃预温的Ⅳ型胶原酶溶液针头多点穿刺灌注,直至组织块变疏松、失去弹性,表面呈龟背状,Ⅳ型胶原酶溶液可循环使用。此过程大约需15-20分钟。③用无菌眼科剪刀剪开肝组织,并去除残存的包膜和纤维结缔组织,放入无菌瓶中,继续在胶原酶液中37℃震荡消化15分钟。④用粗口吸管将消化物吹打为细胞悬液,在冰浴条件下,100目不锈钢滤网过滤,收集肝细胞悬液,移至离心管中。⑤4℃下,50g离心5分钟,去上清,底层沉淀加入红细胞裂解液室温静置3分钟后,继续50g×5分钟,离心1次。⑥收集底层沉淀,用含DNaseⅠ的肝细胞洗涤缓冲液重悬细胞,再用200目不锈钢滤网过滤。⑦4℃下,50g离心5分钟,去上清,无血清DMEM培养基重悬细胞,再次离心,弃上清,沉淀细胞置冰浴中备用。3、收集的肝细胞,台盼蓝染色,计算肝细胞的活率和得率。用含15%胎牛血清的RPMI-1640培养肝细胞,计算肝细胞24小时贴壁率。4、用倒置相差生物显微镜及全自动显微摄影装置对新鲜分离以及原代培养的肝细胞形态和结构进行观察。5、绘制多点穿刺灌注法分离获得的原代成人肝细胞的生长曲线。6、留取多点穿刺灌注法分离的原代人肝细胞培养1天、3天、5天、7天、9天后的上清液,用全自动生化分析仪测定细胞培养上清中尿素(BUN)、碱性磷酸酶(ALP)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甲胎蛋白(AFP)的浓度。7、ELISA法检测多点穿刺灌注法分离的原代成人肝细胞培养上清中白蛋白的含量。8、RT-PCR检测原代培养的人肝细胞的AlbmRNA和细胞色素P450 2E1mRNA的表达。9、安定转化试验检测原代培养的人肝细胞代谢功能。结果:1、采用本课题组建立的多点穿刺灌流法分离成人小块不规则手术切除肝组织的肝细胞,肝细胞的活率是87%±7%,分离得到的肝细胞总数为(2.2±0.7)×10~7/克肝组织,肝细胞贴壁率为75%左右,且镜下观察细胞碎片和其它非实质细胞污染相对较少。此外,本方法还对原代肝脏肿瘤细胞的分离培养具有良好效果,分离成功率几乎达100%。2、全自动生化分析仪间隔连续检测原代成人肝细胞培养上清中生化指标显示ALT和AST的水平都随着培养天数的增加而升高,而ALP无明显变化趋势,AFP始终没有检测到,BUN的含量在短期体外培养中相对保持在一个高水平上。3、ELISA法检测培养的成人肝细胞体外白蛋白分泌量在第三天达到最高峰,以后逐渐下降。原代人肝细胞培养第1天至第7天后细胞上清液中白蛋白的浓度分别是48.2±4.5 ng/ml、55.2±6.9 ng/ml、63.3±6.4 ng/ml、37.0±10.6 ng/ml、22.5±4.9 ng/ml、14.9±5.3、10.0±2.9ng/ml。4、RT-PCR可以检测到多点穿刺灌流法获得的成人原代肝细胞中Alb mRNA和细胞色素P450 2E1 mRNA的表达,分别在374bp和338bp处出现明亮条带。5、人肝细胞在体外培养的7天内均可有效发挥其对安定的代谢转化作用,其中以体外培养的第3天左右转化能力最强,之后有逐渐下降的趋势。结论:1、创建了多点穿刺灌流法分离人肝细胞的实验室操作程序,降低了对肝组织标本的要求,使成人原代肝细胞的获取变得简单、经济、实用,而不再是一项困难的事情。2、通过对多点穿刺灌流法获得人原代肝细胞的功能检测,证实了此方法获得肝细胞在体外培养条件下具备生物学活性和代谢功能,可用作各项研究的人类肝细胞模型。3、对原代肝细胞培养过程中功能活性状况的动态变化进行了系统研究。