红花草莓(Red-flowered strawberry)是草莓家族的新成员,为属间杂种,红花性状是从开红花的沼委陵菜(Potentilla palustris)通过远缘杂交手段导入到开白花的栽培草莓(Fragaria×ananassa)中的。红花草莓是一种新型的观赏兼食用的草莓,可用于园林绿化和盆栽观赏,其花红、果红,具有很高的观赏价值和经济价值。本研究以课题组自育的红花草莓品种‘粉佳人’、‘俏佳人’、‘粉公主’和草莓栽培品种‘哈尼’以及12x白花、香味浓郁、且抗寒的优异种间杂种材料‘YHl5-10’为试材,利用常规杂交育种和倍性育种的方法,对现有的红花草莓品种进行种质创新,使其在花色、花大小、果实品质和抗寒性等方面得到改良,并对杂交后代进行花色与花瓣色素含量遗传分析、利用HPLC-MS方法对花瓣类黄酮种类和含量进行定性和定量分析、利用转录组测序技术和实时荧光定量方法挖掘与红花草莓花色形成的相关基因,从而探讨红花草莓花色形成的分子机理,为人工的调控花色、红花草莓新花色品种选育具有重要的理论和实际意义,主要结果如下：利用红花草莓品种‘粉公主’和‘俏佳人’与草莓栽培品种‘哈尼’进行回交,可以改良红花草莓的果实大小和品质,为培育大果的红花草莓品种奠定基础。试验结果表明,大部分回交后代的植物学性状发生了广泛分离,且广义遗传力均很高(H2>0.85),表明回交群体后代的性状变异主要是由亲本的遗传引起的；回交群体的后代花色出现了不同程度的分离,主要介于父母本的花色之间；大部分回交后代的果实性状显著优于红花草莓亲本。‘粉公主’与‘哈尼’的回交后代群体中,分别约有6.67%的平均单果重和20.00%固形物含量显著高于高亲的‘哈尼’(P<0.05)；同时,筛选出多个大果且品质优红花草莓株系。以上结果表明,利用红花草莓品种与草莓栽培品种进行回交,可以有效的改良红花草莓的果实性状。利用红花草莓品种‘粉公主’、‘俏佳人’和‘粉佳人’进行杂交,可以改良红花草莓的花色,获得颜色鲜艳的红花草莓新种质。试验结果表明,杂交后代花色发生显著分离,花色一直从近白色变化到红色,主要集中分布在粉色与红色之间,浅粉色的后代很少。‘粉公主’与‘俏佳人’的后代中获得了少量的开红色花的后代,约占整体的3.80%,这对于我国红花草莓品种的改良具有重要的意义,之前获得的多为粉色花,最多可达深粉色。很多株系的花色出现花瓣基部色深现象,且个别株系的花瓣重瓣现象明显；杂交后代的果实均较小,粉公主×俏佳人的后代中,只有3.33%的平均单果重显著高于高亲的‘俏佳人’,还有一些后代不育。同时,也筛选了一些花色鲜艳和果实品质优良的株系。以上结果表明,选择花色鲜艳的红花草莓用于亲本进行杂交,可以改良红花草莓的花色,有效地提高观赏性。利用红花草莓品种‘粉公主’、‘俏佳人’与12x优异种间杂种‘YHl5-10’(花大、果实芳香、抗寒)进行倍性育种,可以获得高倍体的红花草莓新种质,并提高红花草莓的抗寒性。试验结果表明,倍性育种正反交的结实率显著不同,以低倍性的红花草莓品种(断)做母本时,杂交结实率高,易获得杂交后代；粉公主×YHl5-10的后代中,分别约有33.33%的花直径和13.33%的可溶性固形物含量显著的高于高亲的‘YHl5-10’；细胞学研究表明,大部分杂种后代的倍性为十倍体(2n=10x=70),还有其他倍性出现,包括：八倍体(2n=8x=56)、九倍体(2n=9x=63)、十一倍体(2n=1lx=77)、十二倍体(2n=12x--84)和十三倍体(2n=13x=91),创造了丰富的倍性试材；同时,筛选了一些花大、果实品质优且具有强烈麝香风味的高倍体杂交后代；对杂交后代及亲本进行半致死温度的测定,分析抗寒性。结果表明,粉公主×YHl5-10的杂交后代中,约有76.4%的抗寒性显著的高于红花草莓亲本‘粉公主’。以上结果表明,通过倍性育种获得高倍体的红花草莓新种质,可以提高红花草莓的观赏特性和果实品质,而且‘YHl5-10’作为亲本,可以有效地改良红花草莓的有抗寒性。应用目视测色、比色卡和色差仪三种方法对红花草莓的杂交后代及亲本进行花色测量,可分为白色、浅粉色、粉色、深粉色和红色五种花色。通过显色反应和紫外-可见光谱初步分析红花草莓杂交后代花瓣的成色物质。结果表明,红花草莓花瓣的成色物质有花青素苷和黄酮类色素,不含有类胡萝卜素；分别对3个组合的杂交后代(粉公主×哈尼、俏佳人×哈尼和粉公主×俏佳人)的花色和花瓣色素含量进行遗传分析。结果表明,红花草莓杂交后代的花色遗传为少数基因控制的质量性状,色素含量遗传为多基因控制的数量性状；利用高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱(HPLC-ESI-MSn)对不同花色的红花草莓杂交后代的花瓣中类黄酮的组分进行定性和定量分析。结果表明,红花草莓花瓣中共检测到7种花青素苷,分别为飞燕草素3-0-(阿魏酰基)-葡萄糖苷(Dp3feG)、矢车菊-3,5-0-二葡萄糖苷(Cy3G5G)、矢车菊素3-O-(阿魏酰基)-葡萄糖苷(Cy3feG)、矢车菊素3-O-葡萄糖苷-5-O-甲酰葡萄糖苷(Cy3foG5G)、矢车菊素3-0-葡萄糖苷(Cy3G)、天竺葵素3-O-葡萄糖苷(Pg3G)和矢车菊素3-O-甲酰葡萄糖苷(Cy3foG),其中矢车菊素类花青素苷在红花草莓花红色形成中起到了关键作用,且杂交后代的白色花瓣中均检测不到花青素苷；利用多元逐步回归分析,红花草莓的花色和花青素苷组成之间的相关性。试验结果表明,红花草莓花瓣的红色程度主要受花青素苷Cy3G的影响,Cy3G是决定红花草莓花色的主要成份,Cy3G的积累有利于红花草莓花色变红；并依据不同花色的红花草莓杂交后代的类黄酮构成成份和含量进行分析,初步绘制了红花草莓花色代谢模式图。系统评估了红花草莓花瓣中类黄酮代谢总通量的流动模式和不同支路的生产力,确定了红花草莓杂交后代的不同程度的红色花瓣形成过程中矢车菊素类衍生物的核心地位。利用高通量转录组测序技术,对红花草莓杂交后代的红色花瓣和白色花瓣进行转录组深度测序。共获得了91835条无冗余unigenes,平均长度为717 bp,其中有47058条unigenes得到了基因的功能注释和预测,几乎渗透到整个生命活动的各个方面,构建了红花草莓花瓣转录组数据库；其中与Nr比对,注释到了38288个unigenes,注释最高频出现的植物为森林草莓(F. vesca),占Nr结果的66.5%,同源性最高；与KEGG数据库比对分析,12832个unigenes参与了32个代谢通路。其中参与代谢途径的unigenes最多,共6446条,这些代谢途径涉及到整个生命活动的各个方面；5000个unigenes在红花草莓杂交后代的红花和白花两个文库间存在显著差异(Padj<0.05),其中有3204个DEGs上调表达；有2375个DEGs参与了283条代谢途径,其中最显著富集的Pathway为适核糖体合成的(Ribosome),有92个DEGs;从红花草莓杂交后代的红花和白花转录组数据库中,挖掘了与花色形成的所有相关基因,其中包括涉及了类黄酮合成、花青素合成、黄酮和黄酮醇合成等的120个结构基因,和75个MYB类转录因子与83个bHLH类转录因子。基于红花草莓转录组注释结果,利用qRT-PCR研究了所筛选的红花草莓花色形成相关基因在不同花色的红花草莓杂交后代花瓣中的转录水平变化,同时结合HPLC-MS技术鉴定和测量了不同花色的花瓣中类黄酮的种类与含量,推测了红花草莓花色形成的机理。红花草莓花瓣中F3’H基因的高表达以及DFR基因和ANS基因的底物特异性,导致流向矢车菊素衍生物的生物量增加,从而矢车菊素衍生物积累,成为红花草莓花瓣中主要的花青素苷；由于FLS基因的竞争作用,导致不同比例的黄酮醇和花青素苷合成,影响了红花草莓的不同红色程度花瓣产生。同时,ANS基因、UFGT1基因和UFGT4基因可能是导致红花草莓杂交后代的白色花瓣不能积累花青素苷的主要原因,又由于白色花瓣中DFR基因的低表达与FLS基因的强烈竞争,导致杂交后代白色的花瓣无法积累花青素苷。