糖尿病作为严重危害人类健康的一类代谢性疾病，世界上患病人口逐年增多。胰岛移植可以治疗糖尿病，却面临着供体缺乏和移植免疫排斥问题，细胞替代治疗的可行性显著。研究发现，胚胎干细胞（ESCs）、诱导多潜能干细胞（iPS）以及成体干细胞（AS）可以体内、外诱导分化为胰岛素分泌细胞，分化细胞可改善、逆转糖尿病动物的高血糖症，为移植细胞替代治疗糖尿病提供了可能性。骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）是存在于骨髓腔内非造血干细胞类的成体干细胞，可以避免利用胚胎干细胞涉及的伦理问题和诱导性干细胞所产生的技术性问题。如何诱导BM-MSCs稳定、高效地分化为功能完全的胰岛β细胞是目前亟待解决的问题。本试验拟在体外分离培养兔BM-MSCs的基础上，对冻存细胞的增殖能力、生物学特性进行鉴定，优化并建立稳定的兔BM-MSCs体外定向分化为胰岛β细胞的诱导方法与技术体系。1.采用红细胞裂解液法分离获取兔骨髓间充质干细胞（BM-MSCs），基于其贴附塑料基质细胞培养板生长的特性体外扩增培养。通过观察形态学，鉴定细胞表面标志，描绘生长曲线等了解兔BM-MSCs生物学特性。红细胞裂解液法操作简便、便于复制，能够分离获得高纯度的兔BM-MSCs，细胞生物学特性稳定，增殖活性好。2.选取P1，P3，P9代细胞进行冻存复苏，台盼蓝染色检测细胞复苏率，观察冻存时间（15d，30d，90d）对各代（P1，P3，P9代）细胞复苏效果的影响；鉴定冻存细胞的增殖及生物学特性，向脂肪细胞诱导分化验证其干细胞多潜能分化特性。结果表明冻存复苏的兔BM-MSCs可继续培养传代，但其传代次数有限；仍然具有多潜能干细胞特性，可以分化为脂肪细胞。冻存的兔BM-MSCs生物学性状相对稳定，同样可以应用于组织工程、细胞移植和基因治疗等方面，为解决BM-MSCs的储备、节省材料和时间提供依据。3.本试验试图利用DNA甲基化酶抑制剂(5-Aza-dC)，探讨甲基化程度降低是否可以增强胰岛特异基因PDX-1的表达，进而促进胰岛细胞分化和β细胞的成熟。利用MTT法筛选出适于诱导分化、且生长损害作用相对小的DMSO浓度。结合实验室先前筛选出5-Aza-dc适宜作用浓度为1μmol/L，DMSO联合高糖诱导兔BM-MSCs分化为胰岛素分泌细胞的研究基础；向不同诱导阶段分别再加入5-Aza-dc联合诱导后进行形态学对比，双硫腙染色结果表明分化细胞均可产生胰岛素，但是未检测到胰岛特异性基因PDX-1的表达；试验未达到预期目的。表明，诱导方案仍需优化。4.本试验旨在优化、建立兔BM-MSCs体外分化为胰岛β细胞的高效诱导技术体系，为细胞替代治疗糖尿病提供足够细胞来源、并为后续研究奠定部分理论基础。利用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27、肝细胞生长因子、β细胞调节素、活化素A、尼克酰胺联合高糖体外诱导兔BM-MSCs定向分化。观察细胞形态学变化，双硫腙特异性染色；免疫荧光染色技术检测分化细胞内PDX-1，Insulin蛋白表达情况；RT-PCR检测与胰岛β细胞分化、内分泌功能相关基因（PDX-1，Insulin）的转录表达；不同浓度的葡萄糖刺激分化终末细胞团，鉴定其胰岛素分泌功能。结果表明，生长因子联合高糖的复合培养基可以诱导兔BM-MSCs定向分化为胰岛素分泌细胞，相对于试验三中的分化细胞，该细胞功能相对成熟完全。