中药材山茱萸是山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)除去果核的干燥成熟果肉，具有补益肝肾、涩精固脱的功效，现代研究证明山茱萸具有较好的调节免疫系统功能的作用和显著的降血糖作用。因此，中医临床用量较大，同时作为常用中成药(如六味地黄丸等)原料，中药生产用量也很大。我国学者根据山茱萸不同栽培品种果实的形状、大小、重量、颜色等对种内性状变异、类型划分进行了初步研究，分为椭圆形果型、长圆柱形果型、圆柱形果型、短圆柱形果型、长梨形果型、短梨形果型。国内外对山茱萸的研究主要集中对其化学成分、药理作用及临床应用等方面的研究，但对种内变异的物质基础——基因缺乏深入研究，不利于山茱萸种质资源的保护和开发利用，本实验室已利用RAPD技术建立了山茱萸优良品种的DNA遗传图谱。还获得了山茱萸ITS完全序列。本实验将现有的RAPD分子标记转化为重复性和特异性更好的序列特征化扩增区域(SCAR)标记。通过对多态性RAPD产物进行克隆和测序，设计更长的引物将RAPD-PCR转变成为经典的PCR。主要结果如下： 1.在实验室确定的改良的CTAB法的基础上，对提取条件又进行了改进，确定了符合SCAR-PCR分析的总DNA的提取方法，该法从山茱萸叶片及果实中提取的总DNA杂质少、质量好，扩增效果良好。 2.对山茱萸的七个栽培品种进行RAPD分析，构建了亲缘关系树系图。 3.用上海生工S系列引物S37、S43、S92对山茱萸及其栽培品种进行RAPD分析，从中筛选特异性的条带ST37、ST43、ST92进行回收、克隆、测序。用PrimetrPremier(v5.0)设计了8对SCAR特异性引物，经过筛选得到结果的引物一共4对。用筛选出来的引物对山茱萸不同栽培品种及其同科植物、混伪品材料进行扩增，经过反复摸索实验条件得到几条引物通用的PCR反应体系： (1) 30μl反应体系：其中10×PCR buffer。2.5μl，dNTP(2.5mM)3.0μl，Mg<'3>(25mM)3.0μl，引物(10μM)各2.5μl，模板DNA(230μg/g～1499μg/g)6.0μl，Taq酶(5U/μl)1.5μl，去离子水9μl。扩增产物在1×TAE电泳缓冲液中用1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕用0.5μg/ml的EB染色，拍照。 (2)扩增程序：94℃预变性8min，变性94℃，1min；退火52℃(ST37A)或55℃(ST37B)或42℃(ST43)或60℃(ST92)，1min；延伸72℃，1.5 min；45个循环(ST37A，ST37B，ST43)或40个循环(ST92)，72℃10 min补齐。 (3)根据本实验室确定的山茱萸ITS序列设计了两对引物，使用的PCR反应体系同上，循环参数为：94℃预变性8min，变性94℃，1min；退火55℃，1min；延伸72℃，1.5 min；40个循环，72℃10min补齐。本实验结果显示：根据特异性条带ST37序列设计的SCAR引物ST37A对7个山茱萸品种及株木、四照花、葡萄、山楂样本的DNA进行SCAR扩增，发现7个山茱萸品种均能产生单一的PCR产物，而且谱带的大小与原始的RAPD标记基本一致。其中两个品种还产生了另一条特异性谱带，可以做为这两个品种的鉴别依据，并且胶图清楚地显示了山茱萸和梾木、四照花、葡萄、山楂产生的谱带截然不同。根据特异性条带ST37序列设计的另一对SCAR引物ST37B对7个山茱萸品种扩增均能产生单一的PCR产物，但纺锤形果型样本的谱带大小比其余六个果型样本的谱带大小短了300bp左右，这条谱带可以做为纺锤形果型的鉴别依据。根据特异性条带ST43序列设计的SCAR引物ST43对山茱萸7个果型扩增产生单一的谱带，而梾木、四照花、葡萄、山楂产生两条谱带，可以做为鉴别山茱萸的依据。根据特异性条带ST92序列设计的SCAR引物ST92对圆柱形果型、长梨形果型两个果型扩增均产生了一条600～700bp的条带，椭圆形果型、短圆柱形果型两个果型产生了一条200～300bp的条带，长圆柱形果型、纺锤形果型、短梨形果型三个果型无扩增，说明ST92可以把山茱萸的七种果型分成三组。另外W<,ITS2>对山茱萸扩增产生单一的PCR产物，而对株木、四照花、葡萄、山楂并没有产生PCR产物。说明这对引物对山茱萸特异性较高，我们可以运用w<,ITS2>进行山茱萸及其混淆品的鉴别研究。