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蒽环类药物是最有效的抗肿瘤的药物之一,但是由于肿瘤细胞对此类药物的天然或获得性的耐受性以及药物对正常组织的毒性,尤其是心脏毒性,使得蒽环类药物在临床应用上受到限制。目前已经发现人的羰基还原酶(carbonyl reductse1,CBR1,Genbank No.J04056),可以还原代谢葸环类抗肿瘤药物,如柔红霉素(DNR),阿霉素(DOX),生成相应的醇代谢物,即柔红霉素醇和阿霉素醇。代谢产物与药物原型比较,抗肿瘤效果显著减弱,还会导致心脏毒性。同时,细胞内的CBR1的含量还会因为蒽环药物的作用而上调表达。CBR1对药物的还原代谢的导致肿瘤细胞对药物耐受并增强了药物的毒副作用。针对以上情况,以CBR1为靶,寻找开发它的抑制剂,与蒽环类抗癌药物的联用既可增强药物的抗肿瘤效果,逆转肿瘤细胞耐药性,还可降低化疗时的毒副作用。我们希望通过我们的工作,找到新的,抑制效果好并具有临床应用前景的CBR1抑制剂。 根据已知的CBR1抑制剂的结构特征,我们通过搜索小分子结构数据库(ACD、CNPD、MDDR)共收集到约180种类黄酮结构类似物,并应用AUTODOCK4程序,从中筛查新的CBR1抑制剂。分子对接结果显示,表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)与CBR1有很好的结合亲和性,很有可能成为新的CBR1抑制剂。而且,EGCG是茶叶中的天然活性成分,具有防癌抗癌,抗氧化等效应,临床上具有广阔的应用前景。因此,为了研究EGCG能否作为抗癌药物增效剂使用,因此我们重点选择EGCG研究其抑制CBR1的分子机制和对柔红霉素抗肿瘤活性的影响。 为了检测EGCG对CBR1活性抑制的分子机制,我们原核表达并纯化了重组CBRl蛋白。用大分子互作仪确认了EGCG和CBR1的直接结合,亲和常数为KD(M)=2.73e-6。建立体外酶活测试体系检测EGCG对CBRl的抑制动力学特征,包括检测EGCG抑制CBRl的还原活性的IC50为0。58μM;EGCG和辅酶NADPH,EGCG和底物Isatin之间均为非竞争性抑制关系;EGCG结构中的没食子酸酯基为抑制CBR1实现的关键部位;EGCG抑制具有pH依赖性,pH的变化引起EGCG的质子化状态的改变,在中性和弱碱性条件(生理pH条件)EGCG去质子化,表现出更强的对CBR1的抑制活性。 为了解析EGCG和CBR1的结合模式,我们对EGCG-CBR1的结合进行分子模拟,点突变CBR1关键氨基酸残基进行验证。结果显示,EGCG的多酚羟基和CBR1活性中心氨基酸通过形成多氢键保证二者的结合。EGCG的没食子酸酯基上的羟基占据了CBR1的催化中心,阻碍了结合底物的进一步催化。EGCG和CBR1结合区域外围的碱性氨基酸Lys95和Arg231通过正电荷对去质子化EGCG的吸引,提高EGCG在活性中心浓度,从而保证EGCG对CBR1高效抑制。 为了在细胞水平检测EGCG对柔红霉素抗肿瘤活性的增效。用自制CBR1的多克隆抗体筛查肝癌细胞内源CBR1的表达量,在高表达CBR1的肝癌细胞株HepG2和SMMC7721.进行EGCG和柔红霉素的联用,EGCG不仅能增强柔红霉素对肝癌细胞增殖的抑制作用,还能增强药物对细胞G2/M期阻滞的效果。 为了证明EGCG对柔红霉素的增效作用是CBR1介导的,通过上调或RNAi下调细胞中CBR1的表达量后再进行药物联用。用低表达的Hep3B细胞株,建立超量表达CBR1的稳定细胞株,EGCG可以逆转外源CBR1导致的细胞对DNR的耐药性。对于高表达CBR1的HepG2,我们用特异RNAi来下调内源CBR1的表达量,HepG2细胞对柔红霉素敏感且EGCG对柔红霉素的增效作用也不显著了。 为了进一步验证EGCG可以抑制细胞对柔红霉素的代谢,我们使用HPLC来分离和测定细胞裂解液中的柔红霉素代谢物——柔红霉素醇的含量,随着细胞裂解液中EGCG的浓度升高,柔红霉素醇的含量梯度降低,说明EGCG通过有效地降低柔红霉素的代谢对药物作用增效。 为了在整体动物水平检测EGCG和柔红霉素联用的效果,建立检测化合物体内作用的人SMMC7721裸鼠移植瘤模型。EGCG对柔红霉素抑制肿瘤有显著的增效作用。测定药物作用前后裸鼠的体重变化,结果显示EGCG不仅自身无毒,还可显著的缓解柔红霉素毒性引起的裸鼠体重的减轻。 综上所述,为了筛查新的CBR1抑制剂,我们搜索小分子结构数据库收集了180余种类黄酮结构类似物,以CBR1晶体结构为基础进行了分子对接,并依据对接结果的指导,选择了具有临床应用前景的EGCG进行研究,我们从分子动力学,细胞毒理学和动物药理学水平,结合计算机辅助结构模拟和HPLC测定药物代谢,对EGCG是否能抑制CBR1的酶活性以及其结合抑制机制,能否真正增效柔红酶素的抗肿瘤作用进行了较为深入的研究。实验结果显示,EGCG通过有效地抑制CBR1对柔红霉素的还原,可以在细胞水平和动物水平增强柔红霉素的抗肿瘤活性,逆转肿瘤细胞对此药物的耐受性。CBR1的抑制剂与蒽环类药物的联用,有利于提高葸环类化合物的临床疗效,同时,增效机制的阐明,也为被CBR家族代谢的药物的合理联合应用提供了理论基础。