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背景、目的 大肠癌(colorectal cancer．CRC)是消化系统常见恶性肿瘤之一，发病率居全球最常见恶性肿瘤的第4位，是我国位居第4位的常见恶性肿瘤。20世纪90年代起，其发病率和死亡率呈逐年增高的趋势，发病年龄也趋于年轻化，在我国占癌症死亡的第5位。大规模的人群普查研究表明，35岁以上的人群中，大肠癌的发病率约为24～32例／10万人口。随着分子生物学、遗传学和生物技术的发展，近几年来我国在大肠癌的基础、临床和预防方面的研究取得了较大的进展。然而迄今对其发病、复发、转移机制的了解仍然十分缺乏。大肠癌的治疗是以手术为主的综合治疗，根治术后的化疗是大肠癌综合治疗的一个重要组成部分。对高危人群(年龄在40以上、有大肠癌家族史或肠息肉患者)进行普查能早期发现大肠癌，但大肠癌病变小时对身体的影响不大，临床无明显表现，CEA特异性又不高，结肠镜检查目前尚未普及，目前大肠癌的早期诊断还缺乏简易有效手段。寻找大肠癌的肿瘤标志物与特异抗原或相关抗原就显得十分重要，以能早期发现大肠癌，使患者早期接受手术治疗，以提高5年生存率。 cDNA文库的应用，为鉴定肿瘤抗原基因奠定了基础，近年发展的鉴定肿瘤抗原的血清学方法—重组克隆表达抗原的血清学鉴定技术SEREX(serological identification of antigen by recombinant cDNA expression libraries)，较直接地鉴定了肿瘤抗原。研究表明，通过构建cDNA文库，进一步筛选，是发现新的肿瘤标志物的有效途径。我们选取大肠癌患者的新鲜癌组织作为建库材料，以λTrip1Ex2噬菌体为载体，应用长距离PCR技术(Long Distance PCR．LD-PCR)，构建了人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库。应用SEREX方法进行筛选，对阳性克隆进行临床与生物活性鉴定，试图能找到与CRC密切相关的抗原蛋白、DNA或mRNA，期望能为大肠癌的早斯诊断、生物治疗以及肿瘤疫苗的研究打下基础。材料与方法1.。DNA的合成:术中取新鲜大肠癌组织标本，用Trizol Ls Reagent试剂提取总RNA，用RT~pcR反转录合成cDNA第1链，用LD一PcR合成cDNA第2链，第2链。DNA经蛋白酶K消化后，用胡I酶切，经chroma spin-4oo柱子过柱除去小于500bp的小片段。2.cDNA与人TriPIExZ噬菌体连接:cDNA与去磷酸化的入TriplExZ噬菌体左、右臂连接，连接产物进行体外包装反应，再转化E.coll’ XLI一blue大肠杆菌，构建成cDNA噬菌体表达文库。3.文库的质量鉴定:指标为滴度、重组率、。DNA片段大小。文库按不同浓度稀释，转化E.coli XLI一blue大肠杆菌感受态细胞，滴定文库的滴度，确定文库容量大小。用ITPG诱导和x一gal显色测定重组率。用PCR方法和动I酶切鉴定文库的重组噬菌体插入的外源cDNA片段大小。4.SEREX筛选:又称重组克隆表达抗原的血清学鉴定技术。首先构建大肠癌cDNA表达文库，然后用大肠癌患者血清进行免疫筛选，进一步鉴定阳性克隆的特性。5，大肠癌患者血清预吸收:制备E.coli XLI一Blue大肠杆菌感受态细胞，制备大肠杆菌E.coli XLI七lue裂解液，对大肠癌患者血清中抗大肠杆菌E.coli XLI一blue抗体的进行预吸收，以消除筛选中的假阳性结果。6.SEREX筛选过程:大肠癌cDNA文库铺90~培养皿，准备文库克隆。见噬斑长出后，用预先20~比正TG溶液浸泡的硝化纤维素膜伽c膜)，42℃诱导4小时转膜，剥膜后进行免疫反应，用大肠癌患者血清作一抗，用碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG抗体作二抗，以氮蓝四哇困BT)和5’一澳一4’一氯一3’一叫噪磷酸(B cIP)进行显色反应，深蓝色噬斑为阳性克隆。7.阳性克隆鉴定:阳性克隆用150~平板扩增，用Qiagen公司的人一DNA试剂盒提取纯化噬菌体DNA，用PCR鉴定阳性克隆cDNA片段大小。8.阳性克隆测序分析:阳性克隆。DNA用Pfu高保真酶做PcR，PcR产物克隆到pUCm一T载体做T一克隆，进行测序。序列生物信息学分析采用NeBI的All Ge妞B越水+EMBL+DDBJ+P DB sequences DateLbase进行BLAST基因比对分析。 39.阳性克隆m丑NA表达:根据cDNA序列设计合成引物，以G3PDH为内对照，用RT~PCR方法检测SEREX筛选获得的有意义的阳性克隆，如干扰素诱导的跨膜蛋白一1样基因(INF一rrMP)mRNA在大肠癌、胃癌、食管癌和肝癌组织中的表达。1 0.阳性克隆蛋白表达:将干扰素诱导的跨膜蛋白一1样(INF一ITMP)cDNA克隆到pET.Trx表达载体，重组表达载体转化BLZI(D E3)plysS大肠杆菌表达融合蛋白。n.患者血清相应抗体检测:用Westem blot方法，以重组pET.Trx表达载体转化BL21(D E3)P lyss大肠杆菌表达融合蛋白为抗原，检测患者血清中的抗干扰素诱导的跨膜蛋白一1抗体，以辣根过氧化物酶标记的(HRpconjugated)山羊抗人IgG作二抗，检测大肠癌、胃癌、食管癌、肝癌患者血清中出现相应抗体的频率。结果1.文库构建:成功构建成3个大肠癌cDNA噬菌体表达文库，滴度分别为2.39xlo乍n刀nd、2.o7Xlo乍丘功叮l、l.s6Xlo6pfi刀ml。重组率分别为97.5%、94.5%、96.5%。文库扩增后滴度分别为3.gxlo‘opfi刀ml