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第一部分:SP-B intron4 A549单克隆细胞株和SP-B intron4del(3-8)m A549单克隆细胞株的建立【目的】构建SP-B intron4 A549单克隆细胞株和SP-B intron4del(3-8)m A549单克隆细胞株。【方法】采用慢病毒感染法将野生型SP-B内含子4过表达载体LV-SP-B-intron4和缺失型SP-B内含子4过表达载体LV-SP-B-intron4-del(3-8)m导入A549细胞。感染后72h在荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光蛋白GFP的表达。使用嘌呤霉素(2μg/ml)筛选培养得到稳定转染SP-B intron4和SP-B intron4del(3-8)m的A549细胞株。采用96孔板法挑选获取单细胞克隆。采用PCR鉴定目的基因。采用Western blot鉴定SP-B蛋白。挑选高效稳定表达相应SP-B蛋白的单细胞克隆扩增培养用于后续研究。【结果】MOI为40,转染72h荧光显微镜下可见A549细胞内GFP表达良好,感染效率达80%,细胞形态良好。嘌呤霉素(2μg/ml)筛选培养3天,可获得携带Puromycin抗性的细胞克隆。96孔板法挑选出单细胞克隆,扩增培养,传代3代,可获得稳定转染SP-B intron4和SP-B intron4del(3-8)m的A549细胞,挑选多个克隆进行鉴定,最终获得4株SP-B intron4 A549细胞株和3株SP-B intron4del(3-8)m A549细胞株,均有相应中间体SP-B-3Flag融合蛋白(29KD)的表达。【结论】成功构建了可稳定表达相应SP-B蛋白的SP-B intron4 A549单克隆细胞株和SP-B intron4del(3-8)m A549单克隆细胞株第二部分:SP-B内含子4基因缺失变异对A549细胞SP-B基因表达能力和高氧耐受力的影响【目的】观察SP-B intron4 A549细胞和SP-B intron4del(3-8)m A549细胞在高氧状态下细胞形态和生物学性状的变化,以及SP-B m RNA和SP-B蛋白的表达变化。研究SP-B内含子4基因缺失变异对A549细胞SP-B基因表达能力和高氧耐受力的影响。【方法】将第一部分获得的SP-B intron4 A549细胞和SP-B intron4del(3-8)m A549细胞置于氧浓度为90%环境下培养。高氧干预0h、24h、48h、72h,分别采用MTT法测定细胞增殖活性,采用LDH法测定细胞损伤程度,采用real-time PCR检测SP-B m RNA表达情况,采用Western blot技术测定细胞SP-B前体蛋白和中间体的表达情况。【结果】高氧干预0h和24h两组细胞生长尚良好,高氧干预48h两组均有部分细胞死亡,高氧干预72h两组均出现大量细胞死亡,SP-B内含子4缺失型明显重于野生型。高氧干预0h、24h两组细胞增殖抑制率和细胞损伤程度差异不明显,高氧干预48h、72h,SP-B内含子4缺失型的A549细胞增殖抑制程度和细胞损伤明显重于野生型,差异均有统计学意义(P<0.05)。在高氧状态下两组细胞SP-B m RNA和SP-B蛋白的表达水平均升高,高氧干预24h、48h、72h,SP-B内含子4缺失型A549细胞的SP-B m RNA表达水平与野生型比较均显著下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。高氧干预0h、24h、48h、72h,SP-B内含子4缺失型A549细胞SP-B前体蛋白(42KD)和中间体SP-B-3Flag融合蛋白(29KD)的表达水平显著低于野生型(P<0.01)。【结论】SP-B内含子4基因3~8模序缺失降低A549细胞在高氧状态下SP-B m RNA及SP-B蛋白的表达能力,SP-B内含子4基因3~8模序缺失降低A549细胞的高氧损伤耐受力,这可能与SP-B内含子4缺失变异增加BPD易感风险的机制有关。