舞毒蛾PBPs的免疫定位及与配体互作的关键位点

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舞毒蛾Lymantria dispar L是一种危害性很大的世界性农林害虫。亚洲型舞毒蛾(Asian gypsy moth)由于雌成虫能飞行扩散、危害寄主更加广泛的特点,已成为国际检疫性害虫,对国际贸易产生很大影响。昆虫的嗅觉在行为中发挥重要作用,目前舞毒蛾的嗅觉传导机制尚未完全清楚,为了更好地研究舞毒蛾的监测和防控技术,了解舞毒蛾触角化学感器及信息素结合蛋白(Pheromone binding proteins, PBPs)的功能,我们利用扫描和透射电子显微镜系统观察了触角化学感器的分布与超微结构;采用免疫组织化学方法研究了LdisPBP1和LdisPBP2在触角化学感器中的表达定位;通过生物信息学技术预钡LdisPBPl和LdisPBP2的三维结构模型与配体互作的可能位点;并在此基础上通过定点突变和荧光竞争结合试验验证了LdisPBP1和LdisPBP2与配体互作的关键位点。主要研究结果如下:1、舞毒蛾触角化学感器的分布与超微结构通过扫描电镜和透射电镜的观察,明确了舞毒蛾雌、雄蛾触角上化学感器的分布与超微结构。结果表明雌雄两性成虫的触角上均有4种类型的化学感器,分别为毛形感器、锥形感器、腔锥形感器和刺形感器。毛形感器规则排列于触角栉齿内侧,单壁较厚,壁上少孔。锥形感器位于栉齿端部,单表皮壁较薄,壁上多孔。腔锥形感器位于栉齿外侧靠近端部,为具缘毛类型,双壁,壁上纵脊间有辐条状的孔道穿过。刺形感器位于栉齿端部,壁厚,壁上无孔,仅端部具有单孔2、舞毒蛾PBPs在触角化学感器中的免疫定位通过免疫组织化学方法,并在透射电子显微镜下观察明确了舞毒蛾的两种信息素结合蛋白——LdisPBP1和LdisPBP2在触角化学感器中的表达定位情况。免疫组织化学定位实验显示,在雄蛾触角感器中,PBP1抗体、PBP2抗体均标记于毛形感器的淋巴液中,而在雌蛾触角感器中,PBP1和PBP2的抗体在毛形感器、锥形感器的淋巴液中都有标记。3、舞毒蛾PBPs与配体互作位点的预测利用生物信息学软件,通过模拟突变、计算突变能量的方法,预测突变能量权重值分别排在前三位的氨基酸位点——LdisPBP1的GLY49、PHE76、TYR41和LdisPBP2的GrLY49、PHE76、ARG112可能是蛋白与配体的互作位点。根据LdisPBP1、LdisPBP2三维结构模型与配体化合物的模拟分子对接结果,预测能够与化合物之间产生氢键或π-π共轭结构的LdisPBP1的Phe36、Lys94以及LdisPBP2的Lys121可能是蛋白与配体的互作位点。4、舞毒蛾PBPs与配体互作的关键位点利用定点突变的生物学技术获得LdisPBP1的4个点突变蛋白:F36A、Y41A、F76A、K94A和LdisPBP2的3个点突变蛋白:G49A、F76A、K121A。荧光竞争结合实验测定了突变体蛋白与化合物分子的结合能力,结果表明LdisPBP1的Y41、F76和LdisPBP2的G49、F76可能是参与蛋白与化合物分子互作的关键位点。
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