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肺癌是一种发病率、死亡率极高的恶性肿瘤。基于2008年GLOBOCAN统计，在男性患者中，肺癌的发病率居首。肺癌新发病例占新发癌症总数的17％，其死亡患者占癌症死亡总数的23％。同时发展中国家对于女性肺癌患者的负担高达宫颈癌的负担。随着对干细胞和肿瘤生物学研究的深入，人们观察到肿瘤中有一小群具有自我更新和再生肿瘤能力的细胞，被称为肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)。目前研究认为CSC是引起临床上化疗失败、肿瘤复发和远处转移的主要原因。研究CSC首要步骤是分离“侧群”(side population，SP)细胞。进一步研究显示SP细胞有自我更新、无限增殖能力及强致瘤性，具有肿瘤干细胞的特性。 近年分子靶向治疗越来越受到人们的关注。Crizotinib(PF-02341066)是一种以ALK和c-Met为靶点的小分子口服药。2011年8月，Crizotinib被美国FDA批准用于临床治疗ALK阳性的非小细胞肺癌。本研究通过研究Crizotinib对路易士肺癌(lewis lung cancer，LLC)细胞株“主侧群”的治疗作用，为临床应用提供实验依据。 材料与方法： 1、分离及鉴定肺癌细胞系LLC“主侧群”细胞 (1)利用Hoechst33342外排实验，分离肺癌细胞系LLC“主侧群”细胞。 (2)利用RT-PCR，Western blot及IF(immunofluorescence)鉴定各细胞亚群中的ABCG2和CD133含量。 (3)利用FISH(Fluorescence in situ hybridization)检测各细胞亚群ALK基因变异情况。 2、Crizotinib对肺癌细胞系LLC“主侧群”细胞表型的影响及其分子机理研究 (1)运用药敏试验测定Crizotinib对肺癌细胞系LLC“主侧群”细胞的最适作用浓度(IC50)和时间。 (2) Crizotinib处理后，AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测细胞凋亡，PI染色检测细胞周期，并利用分光光度法检测细胞内Caspase-3、8、9活性。 3、Crizotinib对肺癌细胞系LLC“主侧群”在裸鼠体内成瘤的影响 (1)观察各亚群的成瘤能力差异。 (2)经Crizotinib治疗后，定期测量肿瘤体积及重量。同时利用单抗CD31检测血管密度。 4、Crizotinib对肺癌细胞系LLC“主侧群”作用机制检测。 (1)应用SYBYL-Ⅹ1.3等软件模拟Crizotinib可能作用的蛋白活性中心，对可能的通路蛋白进行初筛。 (2)实验证明Crizotinib诱导凋亡的可能机制。利用RNA芯片或Westernblot技术优先检测Smad3通路的变化。 结果： 1、利用Hoechst33342外排实验分离LLC“主侧群”细胞并鉴定 利用流式细胞技术确定“侧群”细胞在总体细胞中的比例为0.37％。利用RT-PCR和Western blot分别对LLC“主侧群”细胞进行鉴定。结果表明“侧群”细胞比“主群”细胞的CD133和ABCG2含量高。IF结果同样显示“侧群”细胞比“主群”细胞CD133和ABCG2表达水平高。FISH结果显示LLC“主侧群”细胞均为ALK阴性细胞。 2、Crizotinib对肺癌细胞系LLC“主侧群”细胞表型的影响 克隆形成实验结果显示，处理后“主群”细胞增殖受到抑制，并呈浓度依赖性。Crizotinib对“主群”细胞的IC50值为21.3 nM。Crizotinib和Verapamil(500μM)联合用药抑制“侧群”细胞增殖，IC50值为22.4 nM。分别利用“主侧群”细胞IC50值浓度的Crizotinib对其细胞进行作用，确定Crizotinib“主侧群”细胞的最佳作用时间为24 h。最适作用浓度和时间用于后续试验。研究发现处理后“主群”细胞凋亡增强和G1期阻滞，并且伴随Caspase-3、8、9活性增高。“侧群”细胞未见明显影响。Crizotinib和Verapamil联合用药，结果显示“侧群”细胞出现凋亡和G1期阻滞，同时Caspase-3、8、9活性增高。 3、观察Crizotinib对肺癌细胞系LLC“主侧群”裸鼠荷瘤模型的影响 Crizotinib可以有效抑制LLC“主群”细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，Crizotinib和Verapamil联合用药可以有效抑制LLC“侧群”细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。免疫组化结果显示经治疗的裸鼠瘤内血管密度明显低于对照组。 4、Crizotinib对肺癌细胞系LLC“主侧群”作用机制检测 SYBYL-Ⅹ1.3软件模拟结果提示Crizotinib能够与Smad3蛋白的活性中心结合。Western blot结果显示经Crizotinib处理后Smad2和3总量没有变化，而P-Smad2和3明显增高，进而诱导Smad4含量增高。RNA芯片结果显示Smad2和3RNA含量没有明显变化。 结论： 1、LLC“主侧群”细胞在致癌性和抗药性方面存在明显差异。 2、体内外实验证实Crizotinib能够有效抑制肺癌LLC细胞“主群”增殖，Crizotinib联合Verapamil能够有效抑制肺癌LLC细胞“侧群”增殖。 3、Crizotinib通过激活Smad信号传导途径抑制LLC细胞“主侧群”。