京尼平是一种环烯醚萜类化合物,是一种毒性较低的生物交联剂,它不仅可以与氨基酸等作用制备生物材料,而且还具有保肝、降血糖、降血压等多种药理作用。京尼平苷是京尼平主要的制备原料,京尼平苷来源广泛,且在如杜仲、栀子等植物中含量较高,并且也具有多种药理活性,其中的抗肿瘤活性已被多次报道。由于京尼平是京尼平苷的苷元,具有与京尼平苷相同的母核结构,在体内酶的作用下代谢为京尼平,发生作用,而其抗肿瘤活性报道较少。故本试验在利用新型聚氨酯泡沫固定化纤维素酶制备京尼平的基础上,检测纯化后的京尼平对三种肿瘤细胞的半数致死率,为京尼平应用于抗肿瘤作用提供了一定的依据。同时,聚氨酯泡沫材料是一种原料方便易得、制备方法简单、使用效果良好的多功能材料,其中的聚氨酯软泡以及部分半硬质泡是负载酶类等催化剂的理想材料。而自然界中的纤维素酶来源丰富,资源较多,但利用率差,浪费严重。故本文应用适宜的聚氨酯泡沫材料负载纤维素酶,将该固定化纤维素酶应用于京尼平的制备反应中,可以多次使用,催化京尼平生成反应的进行,同时也大幅提高了纤维素酶的使用效率。本文的主要研究内容和结果如下:1.通过中心复合设计优化法确定了聚氨酯泡沫载体制备的最佳条件,并对制备的固定化纤维素酶的理化性质、重复使用情况、酶动力学参数等进行了检测,其主要检测结果如下:(1)通过中心复合设计优化法制备并优化出的最佳原料用量为:去离子水用量1.62%,聚醚改性硅油用量 0.35%,PEG400 用量 54.26%、MDI用量 43.41%,DBTDL用量0.35%,PEG400/MDI=1.250,在最佳条件下制备的聚氨酯泡沫载体单位体积吸水量的平均值为3.8247 g/cm3。最大载酶率为27.12%。(2)理化性质检测结果显示,纤维素酶被成功负载于聚氨酯泡沫内部,固定化纤维素酶与聚氨酯泡沫载体相比平均孔径改变不大,但孔径分布有所变宽,其横断面外观亦有所改变,XRD、DSC检测结果显示固定化纤维素酶与其相应的聚氨酯泡沫载体均为无定形态。2.探索了固定化纤维素酶最适反应条件、动力学参数以及其循环使用情况。结果为:固定化纤维素酶最佳反应温度为45℃,最适pH=5.5,反应时间成大于等于75 min;游离纤维素酶最佳反应温度为45℃,最适pH=4.5,反应时间应大于等于 65 min。在上述条件下进行循环酶促反应7次后,其酶活为6274.78±294.91 U/g。本文主要通过米氏方程和双倒数作图法对游离纤维素酶和固定化纤维素酶的酶动力学参数进行检测,检测结果为游离酶Y1=0.0557X1+0.0843,R2=0.9374,Kml=0.6613,Vmax1=11.8624;聚氨酯泡沫固定化纤维素酶Y2=0.1991X2+0.1429,R2=0.9153,Km2=1.3933,Vmax2=6.9979。3.在最适温度和pH条件下,对该固定化纤维素酶酶促京尼平苷生成京尼平反应的时间历程、动力学参数、以及循环使用次数进行了检测,检测结果为:在缓冲液pH=5.5,反应温度为45℃的条件下,京尼平生成反应的反应时间应≥75 min。通过米氏方程和双倒数作图法得到固定化纤维素酶在该反应中的酶动力学参数,其检测结果为Lineweaver-Burk 拟合曲线为 Y=2.4660x-0.7660,R2=0.9337,Km=3.2193,Vmax=1.3054。固定化纤维素酶在京尼平生成反应中重复使用7次,京尼平苷的转化率为40.60%。对生成的京尼平粗品进行了纯化,获得了纯度为98.34%的高纯度京尼平。4.利用肝癌细胞株HepG2、乳腺癌细胞株MCF-7和肺癌细胞株A549采用MTT实验方法对京尼平苷和京尼平的体外抗肿瘤活性进行了实验,结果表明京尼平苷和京尼平对HepG2细胞、MCF-7细胞和A549细胞均有显著的抑制作用,其中京尼平苷对上述三种细胞的半数致死率分别为:400 μM、5 μM、155.51 μM;京尼平对上述三种细胞的半数致死率分别为:800 μM、25 μM、274.06μM。