目前，登革病毒（DV）广泛流行于全世界100多个国家和地区，据WHO估计，全球每年约有5千万至1亿人感染登革病毒。我国南方近年来也频发小流行，仅2002年广州和澳门地区就有近万人感染。登革热已经成为一种严重危害人类健康的蚊媒传播疾病，被认为是急需引起重视的一种再现突发性传染性疾病。登革病毒分为4个血清型，DV1～DV4，任何型别的登革病毒感染均可引起一系列的临床症状，包括隐性感染、发热、登革热（DF）及更为严重的登革出血热（DHF）和登革休克综合征（DSS）。登革病毒的初次感染对于同型病毒的再次感染可产生长久的免疫力，但对于其它型别登革病毒的再次感染则仅有部分而短暂的免疫保护作用。血清流行病学的调查研究已经发现，异型病毒的再次感染是引发DHF／DSS的高危因素。目前具有保护性的登革病毒疫苗尚未研制成功，临床上对于登革病毒的感染亦未有特异性的治疗措施，但研究表明及早的临床处理可以减少DHF的发病率和致死率。由于多数登革病毒感染者早期缺乏特异的临床表现，仅有发热、寒战等流感样症状，难以和其它发热疾病和出血热疾病区分，必须依赖实验室的诊断加以确认。因此，为了使感染患者及时得到救治，减少DHF的发病率，建立一种快速、特异的实验室早期诊断方法显得尤为重要。而且，进一步明确感染病毒的血清型对于流行病学和发病机理的研究也是非常必要的，有研究已证实登革病毒感染的血清型与发病严重程度存在着密切的相关性，譬如Ⅱ型登革病毒的感染往往引发较其它3型严重的临床症状。目前，登革病毒的实验室诊断方法主要包括病毒分离、血清学检测和核酸检测。病毒分离是登革病毒感染诊断的金标准，并可进一步用于病毒血清型的鉴定，但是该方法费时而且对于实验室的条件要求较高。尽管病毒核酸的检测方法比传统的病毒分离法更灵敏快速，但是分子生物学方法需要特殊的实验室仪器设备和操作技术，并较易发生污染导致假阳性结果。而血清学检测方法不能用于早期诊断，而且由于存在四种血清型登革病毒和其它黄病毒抗原之间的交叉反应，结果易发生假阳性。此外，对登革病毒的分型诊断也存在问题，目前主要依靠从急性期血样品中分离病毒，结合血清型特异性的单克隆抗体进行免疫荧光检测或利用型特异引物进行RT-PCR鉴定，这两者在操作上均无法达到快速简便和大量筛查的要求。因此，亟需建立一种更为简便特异的登革病毒感染早期诊断及分型诊断方法。登革病毒属于黄病毒科黄病毒属的主要成员，是一种具有包膜的单股正链RNA病毒，基因组长约11kb，编码3个结构蛋白（C、prM／M、E）和7个非结构蛋白（NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5），其中NS1是研究比较深入的非结构蛋白，该蛋白以膜型和分泌型两种形式存在，具有群特异性和型特异性决定簇，但对NS1的功能尚未完全清楚，有研究发现在登革热患者的早期血中存在高浓度的NS1循环抗原，而检测NS1-IgG可初步进行登革病毒的分型，因此，我们推测NS1可望成为登革病毒感染的早期诊断及病毒分型诊断靶标。本研究结合我国广东地区近年主要以Ⅰ型登革病毒流行的特点，选择了Ⅰ型登革病毒NS1蛋白（DV1NS1）为研究的靶抗原，通过对NS1基因的克隆、蛋白表达及其抗原性鉴定，并通过制备一组特异性抗Ⅰ型登革病毒NS1蛋白的单克隆抗体，建立以单克隆抗体为基础的双抗体夹心捕获DV1NS1抗原的酶联免疫学方法，探讨NS1在登革病毒感染早期诊断及分型诊断中的作用和意义。本研究主要分为四个部分：第一部分：Ⅰ型登革病毒NS1基因克隆及抗原性鉴定用RT-PCR方法扩增Ⅰ型登革病毒NS1全长基因，并定向克隆至原核表达载体pQE30中，pQE30为携带6个组氨酸（His-6）标签的融合蛋白表达载体，通过对表达条件和纯化条件的优化，经Ni-NTA亲和层析成功纯化获得融合蛋白，命名为DV1NS1。表达蛋白经Western Blot和ELISA鉴定，证明了可与登革热患者血清和兔免疫血清特异结合，具有良好的抗原性，为进一步研究免疫诊断试剂奠定了基础。第二部分：Ⅰ型登革病毒NS1蛋白特异性单克隆抗体的制备及鉴定本部分研究在成功获得具有抗原性的DV1NS1蛋白的基础上，制备抗Ⅰ型登革病毒NS1蛋白特异性单抗，并对单抗进行免疫学特性研究、抗体识别抗原位点分析以及血清型特异性鉴定。采用三种免疫方案免疫BALB／c小鼠，分别为DV1病毒全程免疫、DV1NS1蛋白全程免疫和两者的混合交替免疫，取抗体效价高的小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞融合，对阳性的克隆细胞株进行有限稀释法亚克隆化，经分别以NS1蛋白和DV1病毒为抗原的两种间接ELISA筛选，结合免疫荧光鉴定，最终获得了10株稳定分泌抗NS1蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。10株单抗Ig亚类测定，9株为IgG1，1株为IgG2a。抗体亲和常数介于10^-6～10^-10 M。Western Blot和IFA鉴定除1株单抗与所有4型登革病毒交叉反应外，其余的9株特异结合Ⅰ型登革病毒NS1，与其余3型登革病毒不发生交叉反应，为血清型特异性单抗。采用相互竞争抑制试验分析单抗识别抗原表位，结果显示10株单克隆抗体识别6个以上不完全相同的抗原位点，并均能和天然病毒抗原结合，为下一步建立双抗体夹心抗原检测方法奠定了基础。第三部分：Ⅰ型登革病毒NS1抗原检测方法的建立根据单抗识别抗原位点、抗体亲和力以及抗体效价测定结果，进行组合配对以筛选出最佳的抗体组合。用酶标记每一株单抗，将每一株单抗作为捕获抗体分别与其它株酶标记单抗作为检测抗体进行相互配对试验，通过检测登革病毒培养上清及检测NS1蛋白的灵敏性和特异性，结合检测正常人血的本底值高低，经反复多次筛选，最终确定了以单克隆抗体1F31A5和HRP-5I41A3组合用于构建检测方法。建立的双抗体夹心抗原捕获法检测重组NS1蛋白的灵敏度为5ng／mL，其线性检测范围为100～2000 ng／mL。进一步检测不同血清型的登革病毒毒株和其它黄病毒的病毒培养液，结果显示，采用血清型特异性单抗建立的双抗体夹心抗原捕获法仅特异的检测到Ⅰ型登革病毒，而与其它病毒无交叉反应，检测方法具有型特异性。本部分研究表明，采用抗体夹心抗原捕获法建立的NS1蛋白检测方法具有高敏感性和特异性，可为登革病毒感染提供一种新的实验室诊断方法。第四部分：Ⅰ型登革病毒NS1抗原捕获ELISA初步临床研究通过对大量临床血清样品的检测，探讨所建立方法在登革病毒感染早期诊断中的价值，并进一步评价其在血清型分型诊断中的作用。采用建立的方法检测了469例正常人血清样品，确立检测的临界值。在469例正常血清样品中，仅有5例为弱阳性，检测特异性达99％。对462例2002～2003年广东地区Ⅰ型登革病毒流行期间采集的血清样品进行检测，结果表明在发病的早期可以检测到高水平的NS1循环抗原，而且直至发病第18天，仍可以检测到血清中存在NS1抗原。在发病后第1～2天、3～5天、6～10天、11～15天和16～20天各阶段采集的血清样品中，NS1蛋白的阳性率分别为52.8％、68.1％、83.8％、50％和20％。对该462例患者血清，同时也进行了登革病毒特异性IgM抗体的检测，发病后1～2天，IgM的阳性检出率仅为17.4％，6～10天IgM阳性率上升至75％，随后可升高至80％并维持至发病后16～20天。通过分析血清中NS1抗原存在和DV-IgM抗体产生的规律，发现在病程的急性期，两者的检测规律一致，但是在此期间NS1抗原保持着较高的阳性检出率。尤其在发病的第1～3天，即可检测到较高水平的NS1抗原存在，表明NS1抗原的检测适合于登革病毒感染的早期诊断。对17例经型特异RT-PCR鉴定为DV1感染的确诊血清进行检测，有14例DV1NS1抗原阳性，因此建立的抗原捕获ELISA检测灵敏度为82％。进一步应用双抗体夹心抗原捕获ELISA检测了20例Ⅱ型登革热阳性血清及1例Ⅲ型登革热阳性血清，结果呈阴性；检测13例日本脑炎病毒感染阳性血清、56例麻疹病毒感染阳性血清、51例汉坦病毒感染阳性血清和20例钩端螺旋体感染阳性血清，结果亦呈阴性，表明建立的方法具有登革病毒血清型特异性而且同其它相关或无关病毒无交叉反应，具有高度的特异性，为分型诊断和鉴别诊断奠定了基础。综合以上四个部分的研究结果，本研究的结论如下：一、成功获得具有良好抗原性的Ⅰ型登革病毒NS1重组蛋白，并进一步制备了多株具有血清型特异性的Ⅰ型登革病毒NS1单克隆抗体，为免疫诊断试剂研制、NS1蛋白功能的研究、登革病毒感染的发病机理及疫苗研制等奠定基础。二、率先建立了双单克隆抗体夹心的NS1抗原捕获ELISA，能灵敏的检测到急性期血中的NS1抗原，适用于登革病毒感染的早期诊断；并可进一步发展为病毒抗原定量分析试剂，用于登革病毒感染患者临床预后的判断。三、率先建立了具有Ⅰ型登革病毒特异性的NS1抗原捕获ELISA，可特异的检测Ⅰ型登革病毒NS1抗原，与其它相关病毒均无交叉反应，具有型特异性，有望应用于登革病毒感染的快速分型诊断或鉴别诊断。