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井冈霉素发酵生产过程中,前体井冈羟胺A会大量积累,极大的影响了产品质量,为了提高产品质量,实验室已成功构建了糖基转移酶工程菌并初步应用于生物转化井冈羟胺A糖基化生成井冈霉素A,但转化效率并不高,本研究实现糖基转移酶、UDPG焦磷酸化酶及葡萄糖磷酸变位酶多基因共表达的工程菌,通过优化蛋白表达量获得最适静息细胞,并对糖基转移酶重组工程菌催化井冈羟胺A糖基化的条件进行优化,找到最适的催化条件。根据GenBank中valG、galU及pgm的基因序列设计引物,将PCR扩增的目的片段进行TA克隆,之后将TA克隆获得的质粒pMD19-T-valG、pMD19-T-galU、pMD19-T-pgm与pETDuet-1依次进行双酶切、连接及转化的步骤来构建糖基转移酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶及葡萄糖磷酸变位酶共表达载体。并通过针对相应的重组质粒以菌落PCR,单双酶切及阳性克隆测序,表明糖基转移酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶及葡萄糖磷酸变位酶已经成功克隆于pETDuet-1中,因此将该工程菌命名为E.coli BL21(DE3)-p ETDuet-valG-gal U-pgm。本研究区别乳糖和IPTG优化糖基转移酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶及葡萄糖磷酸变位酶多基因的蛋白共表达的最佳表达情况。相比IPTG诱导情况,乳糖的最佳诱导条件为重组菌诱导前培养时间为3h,诱导剂添加量为80 mM,在25℃下诱导8 h,糖基转移酶、UDPG焦磷酸化酶和葡萄糖磷酸变位酶占总细胞蛋白分别为10.3%、13.6%、10.4%,并且菌体量能维持在11.3 mg/mL。实验结果表明,使用以乳糖为诱导剂获得最佳诱导条件更加适合大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pETDuet-valG-galU-pgm的蛋白共表达,UDPG积累能够实现了6-7倍的提高。通过实验得出重组工程菌静息细胞催化井冈羟胺A糖基化,以80 mM乳糖诱导获得静息细胞最佳;当延迟底物投料时间至22 h,提高了7%的转化率,菌体浓度为0.01 mg/mL,3%纤维二糖,0.25%底物浓度等条件下,能够实现95%左右的转化率,为了避免产物降解控制催化周期是很有必要的。