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第一部分通过WGCNA筛选与人膀胱癌病理有关的分子标志物目的:通过权重共表达网络分析(WGCNA)研究与膀胱癌临床病理分级有关的差异基因及有关信号通路。方法:从Gene Expression Omnibus(GEO)数据库网站下载人膀肮癌RNA二代测序原始数据。在R软件中调用affy包,limma包和WGCNA包对芯片测序数据进行处理。构建表达矩阵,对样本数据进行分层类聚并筛选低级别(Ta-Tl)和高级别膀胱癌(T2-T4)之间的差异表达基因(Differentially expressed gene,DEG)。采用WGCNA函数包完成离群样本和基因的剔除,实现无尺度共表达网络的构建和基因模块的鉴定,在模块-特征关系图中寻找存在最高相关性的基因模块和相应的临床特征。基于基因显著性和模块身份,WGCNA函数包中networkScreening函数用于筛选目标模块的枢纽基因。枢纽基因(hub genes,HG)和相应临床特征的相关性通过单因素方差分析和独立样本的T检验来检测,并由验证阵列的数据证实目标模块的保守性,以及枢纽基因与临床特征的相关性。在STRING数据库中,使用Cytoscape工具,构建枢纽基因蛋白互作网络。在DAVID数据库中,使用注释工具对枢纽基因行GO(Gene Ontology)功能注释并行KEGG分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)。结果:生物信息学方法处理膀胱癌芯片数据,从93个样本数据里,鉴定出874个上调基因,420个下调基因。发现103个网络枢纽基因,其中4个是蛋白互作网络枢纽节点,COL3A1基因与肿瘤进展具有较高的相关性,功能和通路富集分析证实COL3A1基因高表达与MAPK信号通路和粘着斑相关通路(focal adhesion related pathways)具有较大相关性(FDR<0.05)。结论:生物信息学权重基因共表达网络分析证实COL3A1基因与膀胱肿瘤发生、发展可能具有密切关系。第二部分数据挖掘结合临床样本验证COL3A1表达与膀胱癌临床预后及病理的关系目的:从组织学和临床信息资料基础上验证COL3A1 mRNA及蛋白表达水平是否与膀胱癌预后及病理特征相关。方法:执行线性回归分析来验证测试数据集中的枢纽基因。基于Ocomine数据库进行分析COL3A1在正常膀胱癌和膀胱癌中表达的差异。从GEPIA数据库中获得数据来执行Kaplan-Meier生存曲线分析COL3A1与膀胱癌进展的关系。基于芯片数据集进行COL3A1与膀胱癌生存分析和其与各临床预后指标的ROC曲线分析。分别收集和保存本院临床膀胱癌根治术后的膀胱癌和癌旁组织样本。将收集的膀胱癌和癌旁组织样本制成组织芯片,再采用免疫组织化学方法检测各样本膀胱癌和癌旁组织中COL3A1蛋白表达水平。使用qRT-PCR方法检测收集的膀胱癌和癌旁组织中COL3A1基因mRNA的表达量。结果:线性回归分析结果显示:COL3A1与膀胱癌临床分期具有强相关性(p<0.001)。基于Ocomine数据库分析发现COL3A1基因的表达不仅仅在正常膀胱癌中高表达,而且与膀胱癌进展有着强相关性。根据GEPIA数据库的Kaplan-Meier生存曲线分析发现:在膀胱癌组织COL3A1高表达的病人里,其总生存时间和无病生存期是显著缩短的。测序芯片生存分析和ROC曲线分析也提示COL3A1表达与相关临床预后指标有关。qRT-PCR结果显示膀胱癌组织中COL3A1 mRNA的表达量要比癌旁组织显著提高(p<0.01),组织芯片免疫组织化学结果提示高级别膀胱癌组织中COL3A1蛋白高表达水平比低级别膀胱癌患者升高。结论:COL3A1高表达与膀胱癌的发生和进展密切相关。第三部分敲低和过表达COL3A1对膀胱癌细胞系生物学行为的影响目的:从细胞分子层面研究COL3A1与膀胱癌细胞生物学行为的相关性。方法:通过COL3A1shRNA质粒瞬时转染膀胱癌细胞株EJ和UMUC3,从而构建EJ-shNC,UMUC3-shNC 以及 EJ-shCOL3A1,UMUC3-shCOL3A1 细胞株模型。EJ 细胞转染pcDNA3.1构建质粒过表达COL3A1组和空载质粒组。采用细胞增殖-毒性检测实验(MTT)来检测不同细胞株的增殖能力。采用平板克隆形成实验检测不同细胞株的平板克隆形成能力。应用细胞划痕实验和transwell小室检测各组细胞的迁移能力。应用流式细胞仪检测各组细胞的周期、凋亡情况。用westernblot方法检测细胞的MAPK和EMT相关蛋白的表达水平。结果:通过shRNA技术敲低膀胱癌细胞株EJ中COL3A1的mRNA及蛋白表达水平,MTT、平板克隆实验发现EJ-shCOL3A1细胞株的增殖能力明显降低,流式细胞术发现敲减COL3A1能阻滞膀胱癌细胞的增殖周期,增加膀胱癌细胞的凋亡率。细胞划痕试验也证实COL3A1与膀胱癌细胞系EJ和UNMUC3的迁移能力有关。COL3A1蛋白敲减的EJ细胞中MAPK和EMT相关蛋白的表达水平也受到影响。COL3A1过表达能增加UMUC3的增殖活性。结论:在细胞分子实验层面证实了 COL3A1与膀胱癌细胞的增殖迁移能力有关,进一步佐证COL3A1与膀胱癌的进展有关。