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研究背景与目的：急性心肌梗死是一种常见的、多发的心脏疾病,因其死亡率高及心力衰竭等并发症而严重威胁着人类的健康。传统的治疗方法仅能减缓或改善心肌梗死的病程,不能使已坏死的心肌细胞再生。近年来,许多动物实验和临床前期试验证实,细胞移植治疗法可增加有功能的心肌细胞的数量,改善心脏功能。干细胞中的骨髓基质干细胞(Bone Marrow stromal stem cells, BMSCs),由于其取材方便、可以体外培养增殖、免疫排斥反应小和无伦理道德问题等优点,正在成为组织工程细胞移植术中理想的种子细胞。本实验旨在探讨体外分离培养BMSCs的方法、BMSCs的定向诱导分化及移植治疗MI的细胞学机制,为临床应用提供理论依据。研究内容和方法：(1) BMSCs(?)勺体外分离培养与鉴定：以冲洗法获得4周龄Wistar大鼠胃髓；并以1×107个/ml接种于细胞培养瓶,24小时后首次换液,当细胞铺满培养瓶底80～90%时,再以2×10个/ml的密度进行传代培养。用流式细胞仪检测第3代细胞表面抗原CD29、CD34、CD90(?)勺表达情况对BMSCs进行鉴定。(2)BMSCs体外定向诱导及诱导细胞的鉴定：以5-aza对培养48小时的第3代BMSCs进行诱导,设1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L诱导浓度,24h换液去除诱导剂。取10μmol/L诱导后培养14、21天的细胞,采用细胞免疫化学检测横纹肌肌动蛋白Actin和缝隙连接蛋白43的表达情况。(3)大鼠心肌梗死模型(cute myocardial infarction, MI)的建立：采用开胸结扎左冠状动脉前降支法制作MI大鼠模型,并以心电图、组织切片、TTC染色和心脏外观的变化评价MI模型。(4)移植细胞的标记及MI大鼠心肌内细胞移植：以50μg/ml DAPI标记第3代BMSCs,并调整细胞密度为1×107个/50μL,1小时内将细胞注射入大鼠心肌梗死部位。(5)移植细胞存活与分化的检测及初步治疗效果的观察：在荧光显微镜下观察免疫荧光染色的组织切片,判断是否存在同时发蓝色荧光和红色荧光的细胞。通过心电图检测,组织切片观察及毛细血管密度变化评价细胞移植治疗效果。结果：(1)原代培养24小时后即可见少量的圆形细胞贴壁,后逐渐生长呈长梭形纤维样细胞,有集落形成,12天左右第一次传代。传代培养时刚贴壁的细胞呈圆形,很快伸展为短梭形、长梭形及不规则多边形。传代培养的细胞生长曲线近似“S”形,迅速增值时间3-5天,第7天进入平台期。流式细胞术的检测结果是CD29、CD34和CD90的阳性表达率分别为84.8%、3.2%和95.3%(2)比较诱导结果得出最适诱导浓度为10μmol/L,此浓度诱导的细胞形态类似于心肌样细胞。细胞免疫化学显示,诱导细胞阳性表达Actin和CX43。说明诱导后的BMSCs定向分化为心肌样细胞(3)AMI大鼠模型评价：实验组大鼠与对照组大鼠的心电图相比,出现Q波异常和／或ST段抬高(0.2-0.4mV)和／或T波倒置。另外,MI大鼠心肌组织切片观察到：心肌细胞基本结构紊乱,核固缩且染色加深,有的核甚至溶解消失。TTC染色显示梗死部位显白色,正常组织呈深红色。证明了MI模型的制作成功,成功率为65.51%。(4)细胞移植对MI大鼠的治疗效果初步评价：细胞移植3周后心电图检测显示基本恢复正常。HE染色的组织切片中存在核浆比例较大、生长排列方向与肌纤维一致的细胞。实验组中毛细血管密度大于对照组,改善了心脏的供血功能。细胞移植大鼠的组织切片免疫荧光检测,发现存在既发蓝色荧光又发红色荧光的细胞,说明移植的BMSCs在梗死部位存活并定向分化为心肌细胞。结论：大鼠BMSCs适宜体外分离培养、扩增和诱导分化；5-aza诱导BMSCs定向分化为心肌样细胞,表达心肌蛋白Actin和CX43；结扎左冠状动脉前降支可建立稳定的心肌梗死模型；BMSCs移植3周后存活于心肌梗死部位并定向分化为心肌样细胞,改善了大鼠的心脏功能。