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放线菌是一类非常重要的药用微生物资源,随着从陆生放线菌中发现新代谢产物速度的不断减少,人们将研究方向逐渐转向了海洋,特别是红树林地区。由于其有着不同于海洋和陆地的性质,使红树林微生物具有产生新活性物质的可能性。因此,近年来对红树林地区放线菌的研究已引起人们的关注。
本研究选取从广西红树林地区、深圳红树林地区和泰国红树林地区采集的土壤样品,对其进行预处理,选取不同的培养基,添加抑制剂进行稀有放线菌的分离,从中选取部分代表菌株进行了16SrDNA的序列分析,并对其中的两株新种进行了多相分类,主要研究内容和结果如下:
1、样品采用120℃烘干1h和真空干燥一周两种处理方法,分离结果表明,真空干燥一周处理方法较好。
2、采用土壤浸汁培养基、改良的有机高氏2号培养基、改良的无机高氏1号培养基、豌豆粉琼脂培养基、海藻糖—脯氨酸培养基、HV琼脂培养基和棉籽糖—组氨酸培养基7种培养基,添加100mg/L制霉菌素、20mg/L萘啶酮酸、50~75mg/L重铬酸钾和100mg/L放线菌酮四种抑制剂进行稀有放线菌的分离,从三个地区的红树林土壤样品中共分离到了208株放线菌。其中HV琼脂培养基分离到了53株,分离效果最佳。
3、从泰国红树林地区土壤样品中分离到的放线菌数量最多,共97株,种类也最为丰富,这些菌分布在链霉菌属、小单孢菌属、地嗜皮菌属和栖白蚁菌属四个属。
4、根据形态特征等选取11株代表菌株进行了16SrDNA的序列分析,将其鉴定到属,并构建了进化树进行类群分析。11株代表菌株分布在四个属,分别是链霉菌属、小单孢菌属、地嗜皮菌属和栖白蚁菌属。
5、菌株THV05013和TM205014分别属于地嗜皮菌属和栖白蚁菌属,与其同属典型菌株的16SrDNA序列只有97%左右的相似性,为潜在新种,本研究对其进行了多相分类:
(1)观察了这两株菌在固体培养基上的形态特征,并通过扫描电镜观察了其孢子形态;
(2)采用察氏琼脂、酵母膏—麦芽浸汁琼脂、燕麦片琼脂、无机盐淀粉琼脂、甘油—天门冬酰胺琼脂、马铃薯浸汁琼脂和营养琼脂7种培养基观察了其培养特征。结果表明,菌株TM205014和THV05013分别在察氏琼脂培养基上和酵母膏—麦芽浸汁琼脂培养基上生长状况最佳。
(3)通过淀粉水解试验,NaCl、pH和温度耐受试验等10个试验研究了其生理特征。结果表明,菌株TM205014可水解淀粉,菌株THV05013可产生黑色素;菌株TM205014和THV05013对温度的耐受范围为15℃~45℃;菌株THV05013对pH的耐受范围为pH6.0~pH10,对NaCl浓度的耐受范围为0%~3%;菌株TMZ05014对pH的耐受范围为pH6.5~pH10,对NaCl浓度的耐受范围为0%~10%。
(4)通过HPLC分析了这2株菌的主要糖分和氨基酸组成;最后根据16SrDNA序列构建了系统发育进化树,基本确定了这两株菌为新种。