抑制GRP78表达对细粒棘球蚴原头节生长的影响

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目的:目前,囊型包虫病治疗主要以外科手术为主。但在手术期间囊腔内容物溢出是该病术后复发的最主要的原因,向包虫囊腔内灌注局部化疗药物是阻止该病复发最常用的方法。本研究以体外培养的细粒棘球蚴原头节为研究对象,应用小分子干扰RNA(smallinterfer RNA,siRNA)技术特异性下调GRP78(glucose regulated protein78)在细粒棘球蚴原头节中的表达,探讨特异性下调GRP78对体外细粒棘球蚴原头节的作用。方法:无菌获取细粒棘球蚴原头节,运用Western blot技术检测原头节中的GRP78蛋白表达。在证实细粒棘球蚴原头节中存在GRP78蛋白的基础上,运用电穿孔技术将siRNA-GRP78转染至细粒棘球蚴原头节内,同时设立对照组。用Western blot及RT-PCR技术检测原头节GRP78mRNA及GRP78蛋白表达水平。用0.1%的伊红染色溶液按1:1比例加到样品中,15分钟后,在光学显微镜下根据颜色的变化观察siRNA-GRP78转染不同时间原头节的活力,活的原头节颜色没有变化,但是死的就会被染成红色,实验重复三次,并绘制原头节活力曲线。SEM观察原头节表面超微结构;用Caspase-3活性检测试剂盒检测原头节内Caspase-3酶活性;Western blot检测原头节Caspase-12蛋白表达水平。TUNEL检测siRNA-GRP78转染后对原头节凋亡的影响。结果:RT-PCR检测显示,siRNA-GRP78可降低细粒棘球蚴原头节GRP78mRNA表达水平。Western bolt检测显示,siRNA-GRP78可降低细粒棘球蚴原头节GRP78蛋白表达水平。转染24小时后,正常和对照组原头节的形态和活力几乎没有改变,而siRNA-GRP78组原头节活力下降约50.19%。随着siRNA-GRP78转染时间的增加,siRNA-GRP78对原头节的生长抑制作用越明显。连续观察,9d后siRNA-GRP78组原头节死亡率达87.65%。扫描电镜下观察发现siRNA-GRP78转染初期,原头节体表出现指状突起、顶端体表出现皱缩,随着作用时间的增加,渐出现顶突界面缺损,吸盘变形,虫体表面出现凹陷,指状突起增多,甚至出现虫蚀样损害。Caspase-3活性检测发现,较正常对照组,siRNA-GRP78转染后可使原头节的caspase-3酶活性增加。TUNEL检测发现,siRNA-GRP78转染后可促使原头节发生凋亡。结论:1.运用RNAi技术可以特异性下调细粒棘球蚴原头节GRP78mRNA及蛋白表达。2.抑制细粒棘球蚴原头节中GRP78的表达,可抑制细粒棘球蚴原头节的活力,激活Caspase-3及Caspase-12酶的活性。
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