背景神经病理性疼痛是神经系统原发性损伤或功能异常所导致的痛觉异常或痛觉过敏。创伤、缺血性损伤、感染或炎症、肿瘤、药物和压迫等原因均可以引起神经病理性疼痛。非甾体类抗炎药和阿片类镇痛药治疗神经病理性疼痛的效果差,临床上常使用三环类抗抑郁药和抗癫痫药物进行治疗,但疗效差,副作用大,能够有效缓解50%以上疼痛症状的患者不足50%。神经病理性疼痛的机制尚不清楚,现在的研究多集中在外周初级感觉神经元和脊髓痛觉传递神经元的变化上,所以从解剖上被分为外周和中枢致痛机制;也有作者根据神经系统变化的可逆性与否将神经病理性疼痛的机制分为激活阶段、调节阶段和和修改阶段。神经病理性疼痛机制复杂,在研究中有相互矛盾的结果,一方面研究表明,神经病理性疼痛过程中,痛觉传入神经元末梢在脊髓中释放大量谷氨酸,谷氨酸通过激活NMDA受体提高痛觉传递神经元的兴奋性,并且NMDA受体邻近的NOS被NMDA受体内流的Ca2+所激活,NOS合成的NO可透过细胞膜弥散至突触前膜加速谷氨酸释放,促进疼痛产生;另一方面也有研究表明,NOS及其合成的NO介导了吗啡、可乐定等药物的镇痛作用,抑制NOS的活性可以减弱它们的镇痛作用。为了探讨产生这种结果相互矛盾的原因,本研究选择适当的神经病理性疼痛动物模型,根据脊髓中nNOS、iNOS和eNOS三种一氧化氮合酶的表达及活性变化,选择一种具有重要调节作用的一氧化氮合酶,阐明NOS在神经病理性疼痛中的多样性与复杂性。方法1比较慢性坐骨神经缩窄损伤(CCI)、脊神经结扎(SNL)、保留性神经损伤(SNI)三种神经病理性疼痛模型产生疼痛的效果,分析三种大鼠神经病理性疼痛模型脊髓水平致痛机制,选择一种适合本研究需要的动物模型。150g～200g的SD大鼠19只,随机分为四组(对照组、CCI组、SNL组、SNI组),对照组(n=4)切开左后肢皮肤和肌肉,暴露坐骨神经后立即缝合,作为参照。CCI组(n=4)、SNL组(n=4)和SNI组(n=7)分别于左后肢制作CCI、SNL、SNI疼痛模型。术前3d至术后11d隔日使用机械和热辐射刺激测定术侧后趾,比较它们对疼痛刺激的反应差异。术后15d测痛后,使用4%多聚甲醛灌注大鼠,取L5,6脊髓,进行免疫组化实验;采用抗原癌基因蛋白c-Fos、星形胶质细胞标记蛋白(GFAP)和小胶质细胞标记蛋白(OX-42)抗体分别检测神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的激活状况。2检测神经病理性疼痛大鼠脊髓中MEK-ERK与NF-kappa B信号途径的变化,探讨增加一氧化氮合酶表达的信号途径。雌性SD大鼠12只,体重150～200g,随机分为2组(n=10),对照组和SNI组。对照组实施假手术,SNI组于左肢制备坐骨神经保留性神经损伤模型(SNI)。分别于术前3d、术后即刻、术后1、3、5、7、9、11d测定大鼠对机械刺激产生缩腿反应的次数。术后11d痛觉测定后,每组取3只大鼠用于灌注,应用免疫组织化学方法检测脊髓MEK、p-MEK、p-ERK、NF-kappa B的表达;余下3只大鼠断头处死后分离L4-6脊髓,提取大鼠脊髓的蛋白质,应用Western Blot方法检测p-MEK、p-ERK、NF-kappa B表达。3比较神经病理性疼痛大鼠模型脊髓中神经型(nNOS)、诱导型(iNOS)和内皮型(eNOS)三种一氧化氮合酶的表达及活性变化,评价它们在疼痛中的调节作用。雌性SD大鼠(150～200g)20只,随机分为2组,每组10只,分别为对照组和SNI组。对照组大鼠暴露坐骨神经后立即缝合手术切口,SNI组大鼠于左后肢制备坐骨神经保留性损伤(SNI)模型。术后测定疼痛的变化,确定疼痛模型成功后,于术后第14日断头处死大鼠,截取L4～6段脊髓,分离左右侧脊髓,于-80℃储存对照组手术侧、SNI组手术侧和非手术侧脊髓备用。对照组和SNI疼痛模型组各取5只大鼠脊髓,使用RT-PCR技术扩增nNOS、eNOS和iNOS片段,以β-actin作为内参照,比较SNI组与对照组NOS表达的相对差异。每组余下5只大鼠脊髓于冰上迅速匀浆,分别检测组成型和诱导型NOS的活性。4分析神经病理性疼痛大鼠脊髓中NR2B、nNOS和PSD95受体的表达变化,了解神经病理性疼痛大鼠脊髓中nNOS和NMDA受体在功能上的协调性是否具有结构基础。雌性SD大鼠12只,体重150～200g,随机分为两组(n=6),分别为对照组和SNI组。SNI组于左肢制备坐骨神经保留性神经损伤模型(SNI),对照组为假手术组。分别于术前3d、术后即刻、术后1、3、5、7、9、11d测定大鼠对机械刺激产生缩腿反应的次数。术后11d,每组取3只大鼠用于灌注,应用免疫组织化学方法检测脊髓NR2B和nNOS的表达;每组余下3只大鼠断头处死后分离L4-6段脊髓,提取组织RNA,采用RT-PCR方法检测PSD95的转录水平。5研究神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经型一氧化氮合酶的多样性,比较不同nNOS表达的变化。雌性SD大鼠20只,体重150～200g,随机分为2组(n=10),对照组和SNI组。对照组实施假手术,SNI组于左肢制备坐骨神经保留性神经损伤模型(SNI)。术前3d、术后即刻、术后1、3、5、7、9、11d测定大鼠对机械刺激产生缩腿反应的次数。术后11d痛觉测定后,每组取3只大鼠用于灌注,应用免疫组织化学方法检测脊髓nNOS的表达。每组余下7只大鼠断头处死后分离L4-6脊髓:提取其中3只大鼠脊髓的蛋白质,应用抗nNOS羧基端抗体和WesternBlot方法检测nNOS的表达;提取其中4只大鼠脊髓的RNA,1只大鼠脊髓RNA进行RACE-PCR和Southern Blot实验检测nNOS不同的mRNA,余下3只大鼠脊髓的RNA用于检测不同nNOS的mRNA变化。6比较转染nNOSα或nNOSβ的PC12细胞NF-kappa B转录活性和细胞周期的改变,探讨nNOSα或nNOSβ在功能上的差异性。将携带nNOSα或nNOSβ基因的pcDNA3.0表达质粒转化感受态细胞(由H5α细菌制作),在H5α细菌中扩增后,提纯质粒酶切鉴定。将携带nNOSα或nNOSβ基因的pcDNA3.0表达质粒通过脂质体转染PC12细胞,G418筛选,使用抗nNOS羧基端的抗体,通过免疫组织化学和western blot方法检测nNOS的表达效率。提取经筛选PC12细胞的核蛋白,采用EMSA凝胶电泳阻滞实验检测细胞核NF-kappa B转录活性。经筛选PC12细胞经PI染色后流式细胞仪分选,测定凋亡细胞的百分数。结果1SNI疼痛模型不仅制作简单,而且对机械刺激的痛觉反应高于SNL、CCI模型,三种神经病理性疼痛模型均激活大鼠脊髓背角的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞,激活状况没有差别,所以本研究选择了SNI神经病理性疼痛模型。2神经病理性疼痛时,大鼠脊髓背角星形胶质细胞中MEK-ERK信号转导途径被活化,脊髓背角深层神经元中的NF-kappa B也处于激活状况。3神经病理性疼痛大鼠脊髓中nNOS、iNOS的mRNA表达增加,而eNOS的mRNA表达没有变化;组成型一氧化氮合酶(nNOS和eNOS)的活性显著升高,占总NOS活性的80%,远高于iNOS;所以nNOS相对于eNOS、iNOS在神经病理性疼痛中具有更强的调节能力,因此本研究选择nNOS作进一步研究。4神经病理性疼痛大鼠脊髓背角NR2B和nNOS表达增加,但是脊髓中PSD95转录水平降低,没有足够的PSD95将NR2B和nNOS连接起来,NR2B和nNOS在结构和功能上的协同性受到影响。5大鼠脊髓背角有三种神经型一氧化氮合酶(nNOSα、β和γ)的蛋白表达,神经病理性疼痛时nNOSα表达升高,而nNOSβ降低,可能与疼痛的机制有关。6 nNOSα增加PC12细胞NF-kappa B转录活性,nNOSβ降低PC12细胞NF-kappa B转录活性,但均不改变凋亡细胞的百分数;所以,nNOSα或nNOSβ在功能上具有差异性。结论研究表明组成型和诱导型一氧化氮合酶合成一氧化氮的能力具有差别,产生不同浓度的一氧化氮,对组织或细胞发挥不同的作用;本研究显示细胞膜上的nNOSα和细胞浆里的nNOSβ截然相反地调节NF-kappa B的转录活性;由此可以推断:一氧化氮不仅从不同浓度,而且在细胞不同部位对细胞的生理功能或病理改变有不同的影响。研究表明神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经元NF-kappa B活性增加,COX-2和nNOS表达升高,导致中枢敏化;本研究显示神经病理性疼痛大鼠脊髓中增强NF-kappa B活性的nNOSα表达升高,而降低NF-kappa B活性的nNOSβ表达减弱;因此可以认为神经病理性疼痛大鼠脊髓背角nNOSα和nNOS 0的表达变化可能是致痛机制之一。nNOSα和nNOSβ对NF-kappa B活性有相反的调节作用,如果有影响神经型一氧化氮合酶的药物,但作用于不同的亚型,将对NF-kappa B活性产生不同的影响,这些差异性就可以解释NO调节疼痛效果的矛盾现象。