成人T淋巴细胞白血病病毒1型(Human T-cell leukemia virus type 1,HTLV-1)是一种致癌的逆转录病毒,它的感染能够导致成人T淋巴细胞白血病(Adult T-cell leukemia,ATL)的发生。HTLV-1可以编码一系列的调节蛋白,如p30、p13、Tax和HBZ等。HTLV-1病毒通过调控包括TGF-β在内的多条信号通路,促进ATL的发生。TGF-β信号通路的持续激活在ATL中非常重要,尤其在病毒感染的过程中,TGF-β可以降低正常淋巴细胞的免疫监测功能,从而有助于病毒的持续感染以及感染细胞的存活;与此同时,TGF-β信号通路在病毒的复制、侵染等方面也发挥着关键的作用。目前,TGF-β信号通路在ATL细胞中持续激活的分子机制尚不十分清楚,因此,研究TGF-β信号通路在ATL细胞中持续激活的调控因子具有极其重要的意义。果蝇Zeste基因增强子的人类同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)在多种肿瘤中高表达,且有研究报道EZH2在其他肿瘤中参与了Smad等蛋白的功能调控,同时我们通过预实验发现EZH2在ATL细胞中表达水平较高,那么,在ATL细胞中高表达的EZH2是否与TGF-β信号通路持续激活有关呢?为了解决这个问题,本课题将从以下几个方面进行研究:第一部分:EZH2在ATL中高表达及其机制我们首先通过RT-PCR技术检测了ATL细胞株中EZH2基因的表达情况。我们发现,相较于对照组细胞株(MOLT-4、Jurkat、CEM-T4),ATL细胞株(MT-4、TL-Om1、ATL-T、ATL-2、MT-1、MT-2)中EZH2基因存在不同程度的高表达。随后蛋白免疫印迹实验同样发现HTLV-1阳性细胞株中EZH2蛋白表达明显高于阴性细胞株。为了进一步研究EZH2在ATL细胞株中高表达的分子机制,我们通过电转染法将Tax表达质粒转入ATL-T细胞中,发现HTLV-1编码的Tax蛋白能够增强EZH2蛋白的表达。第二部分:EZH2蛋白在ATL细胞中调控TGF-β信号通路我们首先通过报告基因实验研究了EZH2是否对ATL细胞株中TGF-β信号通路是否具有调控作用。检测发现,EZH2对TGF-β信号通路具有明显的激活且呈现一定的剂量依赖,该激活效果在利用不同的TGF-β信号通路的报告基因质粒条件下均得到证实,而且这种激活作用必须依赖于Smad3的存在。随后,我们通过慢病毒感染的方式构建了沉默EZH2的ATL-T稳定株,并利用报告基因实验检测稳定株中的TGF-β信号通路激活情况。实验结果显示,相比于对照组,在沉默EZH2的ATL-T稳定株中TGF-β信号通路的激活有所下调。因此,该实验进一步证明在ATL-T细胞中TGF-β信号通路受到了EZH2的正调控。随后我们研究发现,EZH2蛋白可以与Smad3蛋白结合且共定位于细胞核内。实验发现,EZH2野生型和缺失SET结构域的突变体均能够在激活TGF-β信号通路,说明EZH2激活TGF-β信号通路时不依赖于其组蛋白甲基化转移酶活性。最后,我们利用免疫共沉淀实验对Smad3蛋白进行了结构域分析,结果表明Smad3蛋白的MH1和MH2结构域参与了与EZH2蛋白的结合。第三部分:EZH2蛋白在ATL细胞中调控TGF-β信号通路的分子机制为了研究EZH2调控TGF-β信号通路的分子机制,我们首先运用双荧光素酶报告基因实验,发现EZH2与Smad3、Smad4协同激活TGF-β信号通路。接着,我们通过免疫印迹证明了EZH2蛋白不会影响Smad3和Smad4的蛋白稳定性。随后,我们发现了EZH2蛋白可以和Smad4蛋白结合。通过免疫共沉淀实验进一步发现,EZH2、Smad3、Smad4三者可以形成三元复合体,并且EZH2可以显著增强Smad3蛋白和Smad4蛋白的结合。第四部分:EZH2对TGF-β信号通路靶基因表达的调控为了研究EZH2是否可以通过激活TGF-β信号通路从而对TGF-β信号通路下游靶基因的表达产生影响,我们首先利用了先前构建好的沉默EZH2的ATL-T稳定株。通过RT-PCR及qRT-PCR实验,我们发现沉默EZH2的ATL-T细胞中TGF-β信号通路靶基因ZEB1、ZEB2、Snail1、ADAM9、HDM2、TWIST1的表达在EZH2沉默组中明显下调,证明EZH2对TGF-β/Smad3信号通路的激活作用在ATL细胞中具有特异性。这些靶基因表达与细胞迁移、侵袭等方面紧密相关,因此我们推测EZH2通过调控TGF-β信号通路靶基因的表达从而对细胞的迁移、侵袭等方面产生影响并最终促进ATL的发生与发展。综上所述,我们通过研究发现,EZH2在ATL阳性细胞株中呈现高表达现象,而且HTLV-1编码的Tax蛋白可以诱导EZH2蛋白的表达。此外,EZH2可以和Smad3蛋白结合且共定位于细胞核内,从而对TGF-β信号通路产生激活,在调控过程中EZH2不发挥其组蛋白甲基化转移酶活性。EZH2、Smad3、Smad4三者可以形成三元复合体,且EZH2增强了Smad3和Smad4之间的结合作用,协同激活TGF-β信号通路并最终影响其下游靶基因的表达。本课题解释了在ATL细胞中EZH2促进TGF-β信号通路持续激活的分子机制,同时为以EZH2为靶点治疗ATL提供新的策略和靶点。