论文部分内容阅读
(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯（（R）-HPBE）作为合成多种血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）的重要手性中间体，参与了众多普利类系列药物的合成，如：贝那普利、西拉普利等。本文研究了基因工程大肠杆菌的构建，及其在不对称还原制备（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用，具有较好的工业应用前景。本研究首先克隆了来自于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶，选择了最为合适的克隆载体，并对其诱导条件进行了优化，优化后的葡萄糖脱氢酶比酶活达到9.5U/mg。然后采用基因挖掘的方式，于枯草芽孢杆菌中克隆获得了羰基还原酶IolS，该重组酶能够高效催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯（OPBE）的不对称还原，生成（R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，对映选择性达到99.5%。利用Ni柱对该酶进行纯化，并研究了纯酶的酶学性质和动力学参数。羰基还原酶IolS的最适pH为6.0，最适温度为30o℃C，在40℃以下具有较好的稳定性；在pH5.57.0的偏酸性范围内能保持75%以上的酶活；对底物OPBE的Km为2.61mmol/L，Vmax为4.18μmol/min·mg，对辅酶NADPH的Km为0.69mmol/L，Vmax为5.26μmol/min·mg。通过与文献报道的羰基还原酶的动力学数据进行对比发现，该酶对OPBE具有较低的Km。对其底物谱进行研究发现该酶对α-酮酯和β-酮酯具有良好的催化活性，对芳基酮不具有催化作用。由于IolS在不对称还原过程中需要价格昂贵的辅酶参与，为解决这一问题，本研究采用羰基还原酶IolS与葡萄糖脱氢酶（GDH）共表达的方法解决辅酶循环的问题。采用了4种共表达模式，包括：双基因串联独立表达质粒（两种串联方式），一菌双质粒，以及双基因融合表达质粒。结果显示：串联独立表达质粒且在下游基因iolS的5’端添加T7启动子序列的方式有利于同时实现两个基因的高水平共表达，并且两者的酶活水平相当，最终选择该种共表达方式。对共表达重组菌的诱导培养条件进行了优化，确定诱导温度为25℃和IPTG终浓度为0.8mmol/L时IolS和GDH在细胞提取液中的酶活均达到最高值：1.5U/mg。研究了共表达重组菌不对称还原OPBE制备（R）-HPBE的反应条件。结果表明：反+应介质为1:1的水和辛醇两相体系，葡萄糖浓度为20%，NADP+度为0.05mmol/L时，通过采用pH调控以及底物流加的策略，可以在12小时内完成330g/L底物的转化，转化率大于99%，产物ee值为99.5%，并通过核磁分析验证为（R）-HPBE。对该重组菌的发酵策略进行了初步探索，结果表明：发酵培养基为TB培养基，种子培养6h后接种，培养4h后进行诱导；发酵16h时IolS酶活达到最高值23.1U/ml；发酵14h时GDH酶活达到最高值21.9U/ml，确定采用发酵培养16h的重组菌进行转化反应。采用发酵后的重组菌进行1L放大反应，菌体干重为10.4g，底物浓度为330g/L，反应12h后转化率大于99%，对映体选择性为99.5%，时空产率达到660g/L·d，产物的纯度和总收率达分别达到99.0%和79.2%。