椎间盘退变(intervertebral disc degeneration, IVDD)的发生发展始于青少年时期,其引起的椎间盘退变性疾病发病率很高,并带来诸如腰腿痛等一系列症状,会导致人们短期或永久的功能障碍,为家庭和社会带来了巨大的经济负担。对于椎间盘退变性疾病,目前主要的治疗方法还主要集中在保守治疗和手术治疗,无法从根源上解决IVDD问题。对于IVDD的生物学治疗,目前的研究主要集中于外源性干细胞的移植修复,不可避免地带来一些缺陷或并发症,一定程度上限制了其深入研究及推广应用。随着椎间盘内干细胞巢(stem cell niches of the intervertebral disc, ISN)的发现及其干细胞迁移理论的提出,ISN内源性干细胞(ISN-SCs)迁移至椎间盘内部过程可能是椎间盘再生的一个重要潜在机制,关于促进ISN-SCs自体迁移-修复也逐渐成为研究IVDD生物学治疗的新方向。但是目前尚缺乏关于椎间盘内ISN-SCs体外特性鉴定及其迁移-修复机制的相关研究,限制了ISN-SCs进行内源性修复椎间盘这一新的生物学治疗策略的发展。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)具有十分广泛的生物学作用,可以通过与其受体MET原癌基因编码的跨膜酪氨酸激酶(proto-oncogene MET coded transmembrane receptor tyrosine kinase, c-met)相结合,介导多种细胞运动和增殖,促进肿瘤生长和转移,对造血细胞和多种干细胞的分化、粘附、迁移等也起着关键的调节作用。基于以上理论基础及研究现状,本研究拟采用大鼠作为实验动物,体外分离、培养ISN-SCs,从细胞多向分化能力、干细胞基因等方面与骨髓源性间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)进行比较,对其特性进行鉴定：制造髓核细胞(nucleus pulposus cells, NPCs)衰老模型,从蛋白和基因水平明确ISN-SCs对衰老NPCs的修复能力；探索HGF/c-met介导ISN-SCs迁移的相关分子机制；为HGF在椎间盘修复研究领域的应用以及进一步深入研究椎间盘ISN-SCs内源性迁移-修复效应提供充分的理论和研究基础,为IVDD的生物学治疗开辟新的思路和方向——促进内源性干细胞迁移。第一部分ISN-SCs的体外分离、培养和特性鉴定研究目的：随着ISN的发现及其理论的提出,ISN-SCs对椎间盘内源性修复作用也逐渐受到重视。然而,目前尚无相关体外研究对ISN-SCs进行分离、培养和特性鉴定,限制了对其展开深入研究。因此,充分地认识ISN-SCs可以为更好地理解椎间盘退变及再生过程。此研究的目的主要是体外证明ISN-SCs的存在,并比较其与BMSCs干细胞特性之间的差异,明确其特定的生物学性能。研究方法：选用Sprague-Dawley大鼠(雄性,10周龄)作为研究对象。按照ISN的解剖区域(骺板外周软骨膜区域),在解剖显微镜下,采用眼科手术器械分离、获取ISN组织,进一步Ⅱ型胶原酶消化获取原代细胞群,贴壁培养并连续传代后纯化ISN-SCs;分离相同大鼠的股骨和胫骨,冲洗骨髓腔,采用密度梯度离心法获取BMSCs,连续传代纯化。将第四代(P4) ISN-SCs和BMSCs用于进一步的分析比较,包括：克隆形成能力,细胞免疫表型,细胞周期,干细胞相关基因的表达水平,细胞增殖和三系分化(成骨、成软骨、成脂肪)能力。研究结果：ISN-SCs和BMSCs两者均符合多能间充质干细胞的基本标准,具有贴壁能力、特定的干细胞表面抗原表达谱以及多向分化潜能；尤其是在成骨分化和成软骨分化方面,ISN-SCs表现出较BMSCs更强的分化能力；此外,ISN-SCs还表达干细胞相关基因(与BMSCs干细胞相关基因表达水平相当),具有较好的克隆形成能力和自我增殖更新能力。研究结论：该研究成功体外分离、培养了ISN-SCs,并对其相关特性进行了鉴定。ISN-SCs属于间充质干细胞家族,与BMSCs相比具有更强的成骨和成软骨分化能力。这对于进一步深入研究ISN-SCs迁移至椎间盘内部从而促进其内源性修复具有重要的意义,同时也为椎间盘自我再生修复的研究提供了不同的生物学路径和全新的视角。第二部分ISN-SCs对衰老rNPCs的修复能力研究研究目的：明确ISN-SCs对衰老NPCs的修复作用。研究方法：分离、培养实验动物(Sprague-Dawley大鼠,雄性,10周龄)的ISN-SCs和NPCS;采用连续传代法制备NPCs衰老模型,并采用衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase, SA-β-Gal)染色法检测衰老模型的有效性；采用第四代(P4) ISN-SCs与衰老的NPCs接触共培养(1：1)一周后,采用甲苯胺蓝染色检测其蛋白聚糖表达水平,采用免疫组化检测其Ⅱ型胶原蛋白表达水平,采用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)检测ACAN和COL2 al的mRNA表达水平,并分别与衰老NPCs对照组和正常NPCs对照组中的表达水平进行比较,鉴定ISN-SCs对衰老NPCs的修复作用。研究结果：SA-β-Gal染色显示连续传代后NPCs衰老率逐渐增加,P3 NPCs未出现明显的衰老(衰老率30±0.5%), P5NPCs衰老率为18.3+0.7%(<20%),P10 NPCs衰老率为86.0±4.6%(>80%)。与正常NPCs(P3)相比,衰老NPCs (P10)的蛋白聚糖甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色强度减弱,ACAN和COL2a1的mRNA表达水平均显著性降低(P<0.05)。接触共培养后,与衰老NPCs相比,共培养细胞体系中的蛋白聚糖甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色强度明显增强恢复至正常水平,ACA AN和COL2al的mRNA表达水平均显著性增加(P<0.05),且与正常NPCs相比无显著性差异。研究结论：采用连续传代法可以制备有效的NPCs衰老模型,PI0 NPCs可达到衰老标准。ISN-SCs对衰老的NPCs具有良好的修复能力,可以进一步用于NPCs的修复研究。第三部分HGF/c-met介导的ISN-SCs迁移机制的研究研究目的：进一步阐明HGF/c-met介导ISN-SCs迁移的细胞信号通路及相关分子机制。研究方法：分离、培养实验动物(Sprague-Dawley大鼠,雄性,10周龄)的ISN-SCs和NPCs；采用连续传代法制备NPCs衰老模型。采用免疫荧光(immunofluorescence, IF)及PCR技术,检测并比较正常和衰老NPCs中HGF的蛋白及mRNA表达水平,并检测ISN-SCs中受体c-met的蛋白和mRNA表达。采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)分析比较正常和衰老NPCs中HGF的细胞外分泌水平。将c-met抑制剂K-252a作用于ISN-SCs后,采用蛋白质免疫印迹(Western blot, WB)检测HGF对胞内磷酸化蛋白激酶(p-Akt)蛋白表达水平的影响,并与对照组进行比较,明确HGF/c-met介导的胞内PI3K/AKT途径的激活。采用Transwell迁移体系,并通过各相关细胞内外信号通路受体阻断剂(K-252a,LY294002)的作用,明确HGF/c-met及其下游胞内PI3K/AKT信号通路的阻断对ISN-SCs迁移的影响。研究结果：IF及PCR分析显示,在ISN-SCs中,受体c-met的蛋白和mRNA存在明显的表达；与正常NPCs相比,衰老的NPCs中HGF的蛋白及nRNA表达水平显著性下降(P<0.05)。ELISA分析显示,与正常NPCs相比,衰老的NPCs培养液中HGF的细胞外分泌水平显著性下降(P<0.05)。WB分析显示,HGF可以显著促进ISN-SCs胞内p-Akt蛋白的激活表达(P<0.05)；而在K-252a作用于ISN-SCs而抑制其c-met受体后,该激活表达效应受到抑制,p-Akt蛋白表达显著性降低(P<0.05)=Transwell迁移实验显示,HGF可以显著促进ISN-SCs迁移运动,增加其迁移的细胞数量(P<0.05)；而在各相关细胞内外信号通路受体阻断剂(K-252a, LY294002)的作用下,HGF的促迁移效应明显受到抑制,迁移的细胞数量显著性减少(P<0.05)。研究结论：受体c-met广泛表达于ISN-SCs,而配体HGF广泛表达于NPCs;随着NPCs的衰老,其HGF的表达和外分泌水平会明显降低。而HGF/c-met信号通路介导了胞内PI3K/AKT途径的激活,进而促进了ISN-SCs的迁移作用；因此,随着IVDD的进展,退变椎间盘中衰老的NPCs对ISN-SCs的促迁移作用可能会减弱,这可能是IVDD进展恶化的一个重要原因之一。这为HGF在椎间盘修复研究领域的应用奠定了新的理论基础——促进ISN-SCs内源性迁移至椎间盘内部；同时也为进一步寻找更为合适的促迁移趋化因子和靶点提供了充分的研究基础；为后续进行椎间盘中ISN-SCs迁移-修复的深入研究创造了客观条件。