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微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)是一种重要的人兽共患原虫,呈世界性分布,主要引起人或动物腹泻。对幼年动物和免疫缺陷患者危害较大,可导致婴儿或生长发育障碍、营养不良等症状,甚至致死性腹泻。目前用于治疗隐孢子虫病的药物主要是硝唑尼特,但效果并不理想,且尚无隐孢子虫疫苗,因此隐孢子虫疫苗和药物的研发有待加强。研究微小隐孢子虫与宿主免疫应答特点将有助于对该病的防治。细胞自噬(Autophagy)是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的降解途径,在清除胞内病原中发挥重要的作用。本实验室张梦鸽等(2018)研究表明,微小隐孢子虫感染早期诱导细胞自噬,自噬发挥清除细胞内虫体作用。据报道调控自噬的因素很多,包括microRNA和MAPK信号通路等。本研究在前期工作基础上,开展微小隐孢子虫感染HCT-8后,microRNA和MAPK信号通路相关分子表达变化,探讨它们在调控自噬及清除虫体中的作用,从微小隐孢子虫调控自噬机制角度揭示微小隐孢子虫致病机制,为该病防治提供靶点和依据。主要研究内容如下:1.微小隐孢子虫感染细胞自噬的检测子孢子感染HCT-8细胞不同时间,western blot检测自噬蛋白的动态表达情况,免疫荧光观察子孢子作用后细胞内EGFP-LC3的分布情况。结果表明,在子孢子感染后0-24h,Beclin1蛋白的表达逐渐上升;LC3-II蛋白的积累变化明显,先是在0-8h内逐渐上调,在12h是出现了一个小的下调,而18-24h又继续逐渐上升;p62蛋白在0-8h内表达量很少,从12h开始逐渐上升。以上结果表明在0-8h微小隐孢子虫能够诱导HCT-8细胞发生自噬,12h-24h抑制自噬。同时,微小隐孢子虫引起了EGFP-LC3在子孢子附近发生聚集。2.MiR-30a和miR-26a在微小隐孢子虫调控自噬中的作用2.1微小隐孢子虫调控HCT-8细胞自噬相关microRNA的筛选收集子孢子感染HCT-8细胞不同时间的样品,提取总RNA并合成cDNA,用荧光定量PCR检测miR-23a、miR-375、miR-26a和miR-30a的动态表达变化。结果表明,miR-30a在虫体感染后0-8h呈现逐渐下降的趋势,而在12h-24h逐渐升高;miR-26a在0-8h内呈较低水平的表达,在12h-24h持续升高。miR-26a和miR-30a的表达与虫体调控自噬相关蛋白的表达变化趋势一致。而miR-23a和miR-375在0-24h内也具有差异性表达,但其差异性表达规律同自噬相关蛋白的表达没有明显的联系。2.2 MiR-26a和miR-30a在微小隐孢子虫调控细胞自噬中的作用干扰HCT-8中miR-26a和miR-30a的表达,子孢子感染细胞后,用western blot检测自噬相关蛋白表达。结果表明,同N.C+C.parvum组相比,抑制miR-30a时,Beclin1和LC3-II蛋白的表达明显上调,且p62蛋白明显被抑制;上调miR-30a的表达时,结果相反;上调miR-26a时,Beclin1蛋白的表达变化不显著,但LC3-II的积累显著增加,且显著抑制p62的表达;抑制miR-26a时,Beclin1蛋白和LC3-II变化不显著,但p62的表达显著增加。表明微小隐孢子虫能够通过miR-30a和miR-26a调控自噬,miR-30a起负调控作用,miR-26a正调控自噬。2.3 MiR-26a和miR-30a对微小隐孢子虫增殖的影响干扰HCT-8中miR-26a和miR-30a的表达,子孢子感染细胞后,用荧光定量PCR检测虫体的数量,对细胞内EGFP-LC3的分布情况进行免疫荧光观察。结果表明,同N.C+C.parvum组相比,抑制miR-30a时,虫体数量明显减少;上调miR-30a的表达时,结果相反;上调miR-26a时,虫体数量明显减少;抑制miR-26a时,虫体数量无显著差异;miR-30a-mimic、miR-26a-inhibitor能够促进ERFP-LC3在微小隐孢子虫附近聚集。表明微小隐孢子虫上调细胞miR-30a和抑制miR-26a的表达有利于虫体生存。3.MAPK信号通路在微小隐孢子虫调控自噬中的作用3.1微小隐孢子虫激活MAPK信号通路收集子孢子感染HCT-8细胞后不同时间的蛋白样品,通过western blot检测MAPK信号通路蛋白的磷酸化水平。结果表明,在虫体感染后0-8h ERK磷酸化持续升高,在12h出现下降;P38 MAPK在感染后2-24h内均有不同程度磷酸化;而JNK表达无明显变化。干扰HCT-8中miR-26a的表达,子孢子感染细胞后,用western blot检测ERK和P38 MAPK磷酸化水平。结果表明,抑制miR-26a时,ERK和P38 MAPK磷酸化明显上调;上调miR-26a的表达时,结果相反。表明微小隐孢子虫能够通过抑制细胞miR-26a的表达促进ERK和P38 MAPK磷酸化。3.2抑制ERK和P38 MAPK表达对微小隐孢子虫调控自噬的影响抑制细胞ERK和P38 MAPK通路磷酸化,子孢子感染细胞后,通过western blot检测自噬相关蛋白的表达。结果表明,同C.parvum相比,抑制ERK和P38 MAPK通路磷酸化后,Beclin1和LC3-II的表达明显上调,p62的表达有一定的下调。表明微小隐孢子虫能够通过ERK和P38 MAPK通路磷酸化抑制自噬。3.3抑制ERK和P38 MAPK表达对微小隐孢子虫增殖的影响抑制细胞ERK和P38 MAPK通路磷酸化,子孢子感染细胞后,通过荧光定量PCR对微小隐孢子虫的胞内增殖情况进行检测,对细胞内EGFP-LC3的分布情况进行免疫荧光观察。结果表明,抑制ERK和P38 MAPK通路的磷酸化后,虫体数量明显减少,能够促进ERFP-LC3在微小隐孢子虫附近聚集。表明微小隐孢子虫能够通过激活ERK和P38 MAPK通路有利于虫体生存。综上所述,微小隐孢子虫感染HCT-8细胞后0-8h能够诱导HCT-8细胞发生自噬,12h-24h抑制自噬;微小隐孢子虫能够通过上调细胞miR-30a的表达抑制细胞自噬,有利于虫体生存;也可能够通过抑制miR-26a的表达,进而促进ERK和P38 MAPK磷酸化,抑制自噬,有利于虫体生存。本研究阐明了微小隐孢子虫通过microRNA-MAPK信号通路对细胞自噬的调控作用,发现了一种新的微小隐孢子虫胞内生存机制,这对于揭示微小隐孢子虫的致病机制和该病的防治具有重要意义。