研究背景类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种以慢性进行性、侵蚀性关节炎症为主要临床特点的自身免疫性疾病,其基本病理特征是滑膜炎、血管翳形成,关节软骨、骨骼损伤,最后造成关节变形和功能障碍。临床可并发肺部疾病、心血管疾病、恶性肿瘤、抑郁症等疾病,不但使患者的身体机能、生活质量、社会参与程度降低,还会产生沉重的经济压力。对于RA的病因和发病机制,现代医学的研究还未得出明确结果,没有针对性的有效治疗方法,最多能够达到缓解症状,控制病情恶化的疗效,但现有的治疗药物存在着副作用大、停药易反复、价格昂贵等问题,寻求有效的中药处方治疗RA,具有重要的临床意义。中医在RA治疗中有独特的优势,经过数千年的临床实践和学术传承,在RA的诊疗方面积累了丰富的经验。临床上中药处方能够充分发挥中医特色思维方式,在缓解关节症状、延缓病情进展方面有肯定的疗效,而且具有安全性良好、患者长期服用无明显毒副作用、调节患者整体状态的优势。寇秋爱教授自拟二四汤对RA予以论治,药味精简,成本价格较低廉,在长达十几年的临床应用中验证了二四汤具有良好的安全性与有效性,在类风湿关节炎的治疗中可以更全面地缓解症状、控制病情进展。寇秋爱教授指导的一项关于二四汤的临床研究,以二四汤日1剂作为试验组,将硫酸羟氯喹200mg/日作为对照组,研究结果显示治疗4周后试验组与对照组的DAS28评分有统计学差异,试验组疗效优于对照组。临床观察中已初步显示,二四汤能够有效减轻RA患者的临床症状,降低CRP、ESR炎症指标、改善关节功能,且暂未发现明显不良反应。网络药理学作为近年来兴起的新型药物研究方式,具有整体性、系统性的特点,它与中医的整体观念与中药的多靶点作用机制相合。网络药理学应用于中药复方研究是中医药整体性研究的新趋势,切合了中医药作用机制相关研究的发展需要,为中医药的现代化研究和对中药复方多靶点作用机制的探索提供了全新的发展方向。研究目的1.基于既往临床研究已证明二四汤用于治疗RA的有效性,本研究通过模型动物实验观察二四汤对胶原诱导型关节炎（CIA）大鼠的干预作用与安全性,进行二四汤的药效学研究,分析阐释二四汤对类风湿关节炎的改善作用,科学评价二四汤处方的药效。2.采用网络药理学研究方法构建类风湿关节炎的疾病分子生物网络,探寻二四汤方剂治疗RA的有效成分、药物靶标、信号通路,分析其潜在作用机制,为二四汤治疗类风湿关节炎的深入机制研究做好前期准备。3.在药效学实验研究的基础上,结合网络药理学分析结果,通过检测相关靶点的表达水平,进行二四汤对类风湿关节炎的干预作用机制探讨。研究方法1.本课题在既往二四汤相关临床研究的基础上,通过模型动物实验观察二四汤对胶原诱导型关节炎（CIA）大鼠的干预作用与安全性,分析阐释二四汤对类风湿关节炎的改善作用,进一步对二四汤处方的药效进行科学评价。2.运用网络药理学方法对二四汤的药物组成进行分析,并从分子网络的角度更深层次地探析它治疗RA的潜在机制,分析疾病、药物靶标,进行通路富集,选出基因富集较多的通路,为后续对二四汤治疗类风湿关节炎机制的深入研究做好前期准备,提供一定的指导方向,也为中药复方分子生物学作用机理分析及RA的临床治疗思路提供依据及参考。3.在药效学实验的基础上,选取相关网络药理学靶点,检测其表达水平,验证探讨二四汤对RA的干预作用机制,为临床应用二四汤治疗RA提供实验药理学依据。研究结果1.二四汤的药效学研究:二四汤能够明显降低CIA大鼠关节肿胀程度及肿胀指数,改善大鼠关节滑膜组织病理变化,减少炎细胞浸润,抑制滑膜血管新生。超声影像显示关节滑膜增生程度评分与增生面积下降,提示二四汤可以抑制RA大鼠滑膜增生,从而减轻RA关节损伤。2.二四汤的网络药理学研究:通过网络药理学的研究方法,系统总结了二四汤治疗类风湿关节炎的潜在活性成分,分析预测到二四汤复方中12味中药中的219个活性成分,以及二四汤作用于类风湿关节炎的108个相关靶点,其中网络拓扑学排名前10的靶点蛋白有 TNF、IL6、IL1β、VEGFA、CXCL8、TLR4、CCL2、PTGS2、MMP9、JUN;利用Metascape数据库进行了 GO富集分析及KEGG通路分析,结果表明二四汤在RA的治疗可能主要与调节脂质与动脉粥样硬化、TNF信号通路、IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、癌症相关通路、Toll样受体信号通路等多条信号通路有关,每条通路富集多个基因,体现了二四汤多靶点、多通路的特点。本研究可以为二四汤治疗类风湿关节炎更进一步的作用机制研究奠定基础。3.二四汤的干预机制研究:与空白组比较,模型组大鼠血清TNF-α和IL-1β水平明显升高,具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较,二四汤高剂量组及甲氨蝶呤组大鼠TNF-α和IL-1β水平明显下降（P＜0.05或P＜0.01）;同时二四汤中剂量组大鼠血清TNF-α水平也出现明显下降（P＜0.01）。与空白组比较,模型组大鼠关节滑膜组织VEGFR2和CD31表达明显升高,具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较,二四汤中、高剂量组及甲氨蝶呤组大鼠关节滑膜组织VEGFR2和CD31表达明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。研究结论:1.二四汤能够改善大鼠的炎症反应与滑膜血管增生。2.二四汤通过多成分、多靶标、多途径的方式对RA发挥治疗作用,其可作用的靶点主要与炎症反应和血管新生有关,可能作用的信号通路涉及血管疾病与炎症反应,发现二四汤在RA的治疗可能主要通过抗炎与抑制血管新生发挥作用。3.二四汤能够降低TNF和IL-1β等促炎因子水平,抑制VEGFR2与CD31的表达,通过抑制牛Ⅱ型胶原诱导RA大鼠关节的炎症反应与血管新生,改善RA滑膜炎症,减少滑膜增生,达到减轻RA关节损伤的作用。