肌腱病是常见的运动损伤性疾病之一,常见的肌腱病有：跟腱炎、冈上肌腱炎、网球肘、跳跃膝等,占运动员职业病的48%以上。在普通劳动人群中,发病率可达40%以上。由于目前肌腱病的病因不明,加上治疗手段有限,大约30%的肌腱病患者保守治疗无效,转为难治性肌腱病。肌腱病严重影响热爱运动人群的生活质量和运动员的运动生涯。人在正常生理情况下,运动过程中肌腱受到牵拉所导致的微损伤与肌腱自身的修复过程保持着一定的动态平衡。当这种动态平衡被打破,将随之产生病理改变,使肌腱微损伤加剧,如不及时干预将最终发展成为肌腱病。临床研究发现,肌腱病患者的肌腱组织中普遍存在着异位骨化,而异位骨化正是肌腱病的重要病理表现之一。异位骨化产生原因可能是肌腱过度使用引起的肌腱微小损伤累积所致,但肌腱中骨化的组织来源还不十分清楚。肌腱细胞是肌腱组织中的主要功能细胞,它具有合成和分泌细胞外基质的功能,参与肌腱微损伤的修复。但肌腱细胞作为终未细胞,不具备自我更新能力,自身修复功能弱,没有分化潜能。肌腱中的骨化组织需要一种骨的前体细胞来分化形成骨组织,但是骨组织的来源仍不清楚。有研究发现肌腱组织中存在着另外一种细胞,并命名为肌腱干细胞,它具有多向分化潜能,是肌腱细胞的前体细胞,也是肌腱细胞唯一来源,其自身分化能力强,直接参与肌腱微损伤的再生与修复。因此,肌腱干细胞可能对肌腱微损伤修复起到决定性作用。研究肌腱干细胞成骨分化调控对肌腱微损伤修复的作用及机制具有重要的科学意义和临床价值。物理治疗特别是偏心训练对肌腱病有着良好的治疗效果。机械应力加载是偏心训练发挥治疗作用的主要因素。然而,过度的机械应力加载却是导致肌腱异位骨化的重要因素。机械应力加载对肌腱病具有治疗和致病双重作用,其潜在机制目前尚不清楚。前人报道,在一定的牵伸条件下,肌腱干细胞向肌腱细胞分化的趋势起主要作用；而在有些牵伸条件下,肌腱干细胞表现出向成骨细胞方向分化的趋势为主；这些研究结果提示肌腱微损伤与修复过程中,一定的牵伸条件可能导致肌腱干细胞向成肌腱分化有利于肌腱微小损伤的修复,也可导致肌腱干细胞向成骨细胞方向分化,加重肌腱微损伤,导致肌腱自身修复失败。机械应力加载如何控制肌腱干细胞分化是肌腱病发病机制研究的重要问题之一。mTOR(mammalian target of rapamycin)被称为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,是一种进化上十分保守的丝苏氨酸蛋白激酶,其中的TOR分子通过磷酸化其下游分子发挥生物学作用。mTOR有两类复合物：mTORC1和mTORC2.两种复合物功能各异,关于mTORC1的研究相对较多。mTORC1在调控细胞的生长和能量代谢中起着十分重要的作用,其参与了核苷酸合成、蛋白质翻译、脂肪生成、糖酵解与自吞噬等重要的生理过程。其催化底物为核糖体蛋白s6激酶(p70s6k)和真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)。p70s6k的Thr389位点被磷酸化而激活,正向调控蛋白的翻译,促进核蛋白活性增加从而提高蛋白的翻译；相反,4E-BP1则负向调控蛋白起始因子,其磷酸化后与真核翻译起始因子4E (elF4E)分离,使eIF4E与eIF4G结合/形成elF4F复合物,提高蛋白的翻译起始率。mTORCl作为本课题主要的研究对象,可以被其特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin)所抑制。另一种mTOR复合物,mTORC2主要参与肌动蛋白细胞骨架调控、葡萄糖代谢、脂肪形成、细胞凋亡等生命活动。mTORC2不能被雷帕霉素所抑制。多项研究表明,机械应力可以增加mTORC1下游蛋白p70S6k的磷酸化,说明机械应力可以激活mTORC1信号通路。使用mTORC1特异抑制剂雷帕霉素或mTORC1基因敲除可以对成骨分化起到刺激或抑制作用。因此,机械应力可能通过mTORC1信号通路调节肌腱干细胞的成骨分化,但其机制尚不清楚。基于前人的报道,我们提出以下假说：机械应力载荷可引起肌腱干细胞中mTORC1信号通路的改变,从而影响肌腱干细胞的成骨分化。我们课题设计为：体外分离培养大鼠跟腱来源的肌腱干细胞,并在Flexcell FX-5000应力加载系统中进行不同幅度的牵伸,分别应用Real-time PCR和Western blot检测牵伸后肌腱干细胞的成骨分化相关因子Runx2和OSX的表达情况。加入mTORC1特异性抑制剂雷帕霉素抑制肌腱干细胞中的mTORC1信号通路,在机械牵伸后,分别应用Real-time PCR检测Runx2和OSX的表达情况,明确牵伸情况下mTORC1信号通路在肌腱干细胞异常成骨分化中的作用。除了对细胞进行不同幅度机械牵伸,我们还建立了可模拟不同牵伸负荷的动物模型。在前人研究异位骨化的动物模型基础上,我们应用石膏固定模拟不同幅度的牵伸。通过免疫组化染色和Micro CT扫描检测应力对于异位骨化的影响。给实验动物腹腔注射雷帕霉素抑制体内mTORC1信号通路,研究mTORC1信号通路在肌腱异位骨化中的作用。根据以上假设,我们将课题研究分三部分。1.不同载荷机械牵伸对跟腱干细胞成骨分化及跟腱异位骨化的影响1.1分别从基因表达水平和蛋白表达水平两个方面着手,研究肌腱干细胞在不同牵伸条件下,成骨分化指标Runx2和OSX的表达水平及变化趋势。1.2实验分组：无牵伸对照组(NS),4%牵伸强度组(4%),12%牵伸强度组(12%)。1.2.1不同牵伸强度对Runx2和OSX基因表达水平影响应用Real-time PCR检测不同牵伸条件下跟腱细胞RUNX2和OSX基因的表达量,结果显示,4%机械应力刺激下跟腱细胞RUNX2和OSX基因表达较未经机械应力刺激的细胞显著下降(P<0.05)；12%机械应力刺激下跟腱细胞RUNX2和OSX基因表达较未经机械应力刺激的细胞显著升高(P<0.05)。1.2.2不同牵伸强度对Runx2和OSX蛋白表达水平影响应用Western blot检测不同牵伸条件下跟腱细胞RUNX2和OSX蛋白的表达量,结果显示,4%机械应力刺激下跟腱细胞RUNX2和OSX蛋白表达较未经机械应力刺激的细胞显著下降(P<0.05)；12%机械应力刺激下跟腱细胞RUNX2和OSX蛋白表达较未经机械应力刺激的细胞显著升高(P<0.05)。1.2.3应用HE染色及Micro CT扫描检测不同牵伸强度对跟腱异位骨化的影响1.2.1实验分组：无牵伸对照组(Ctrl),低幅度牵伸组(LE),高幅度牵伸组(HE)。1.2.2不同牵伸强度对跟腱异位骨化的影响1.2.3Ctrl组、LE组和HE组大鼠右侧跟腱HE染色显示,三组跟腱均有异位骨化发生,出现骨髓腔,成骨样细胞。LE组较Ctrl组异位骨化程度轻,而HE组较Ctrl组及LE组异位骨化程度要中重。Ctrl组、LE组和HE组大鼠右下肢Micro CT扫描显示,LE组异位骨化BV/T、Tb.N、Tb.T数值均较Ctrl组显著下降(P<0.05)；HE组组异位骨化BV/TV、Tb.N、Tb.T数值均较Ctrl组显著升高(P<0.05)。2.不同幅度机械应力对跟腱细胞及大鼠跟腱mTORC1信号通路的影响2.1从蛋白表达水平着手,研究肌腱干细胞在不同牵伸条件下,磷酸化p70s6k的表达水平及变化趋势。2.1.1实验分组：无牵伸对照组(NS),4%牵伸强度组(4%),12%牵伸强度组(12%)。2.2.2机械牵伸对肌腱干细胞中磷酸化p70s6k蛋白表达水平的影响应用Western blot检测不同牵伸条件下跟腱细胞p-P70S6K蛋白的表达量,结果显示,4%机械应力刺激下跟腱细胞p-P70S6K蛋白表达较未经机械应力刺激的细胞显著下降(P<0.05)；12%机械应力刺激下跟腱细胞p-P70S6K蛋白表达较未经机械应力刺激的细胞显著升高(P<0.05)。2.2.3应用免疫组化染色检测不同牵伸强度对跟腱磷酸化p70s6k表达水平的影响2.2.1实验分组：无牵伸对照组(Ctrl),低幅度牵伸组(LE),高幅度牵伸组(HE)。2.2.2不同牵伸强度对跟腱mTORC1信号通路的影响各组大鼠右侧跟腱免疫组化染色显示,LE组跟腱细胞磷酸化p70s6k蛋白表达量较Ctrl组显著下降(P<0.05)；HE组跟腱细胞磷酸化p70s6k蛋白表达量较Ctrl组及LE组显著升高(P<0.05)。3.抑制mTORC1信号通路对机械应力诱导的跟腱细胞成骨分化和跟腱异位骨化的影响。3.1蛋白表达水平方面着手,研究肌腱干细胞在不同牵伸条件下以及雷帕霉素干预下,成骨分化指标Runx2和OSX的表达水平及变化趋势。3.2实验分组：无牵伸对照组(NS),4%牵伸强度组(4%),4%牵伸强度加雷帕霉素组(4%+Rapa),12%牵伸强度组(12%),12%牵伸强度加雷帕霉素组(12%+Rapa)。3.2.2不同牵伸强度及雷帕霉素干预对Runx2和OSX蛋白表达水平影响应用Western blot检测雷帕霉素对不同牵伸条件下跟腱细胞RUNX2和OSX蛋白表达的影响。未经机械应力牵伸的NS组及NS+Rapa组,NS+Rapa组RUNX2和OSX蛋白表达量较NS组显著下降(P<0.05)。4%机械应力刺激下的4%组和4%+Rapa组,4%+Rapa组RUNX2和OSX蛋白表达量较4%组显著下降(P<0.05)。12%机械应力刺激下的12%组和12%+Rapa组,12%+Rapa组RUNX2蛋白表达量较4%组显著升高(P<0.05)。3.2.3应用免疫组化染色检测不同牵伸强度及雷帕霉素干预对跟腱异位骨化的影响3.2.1实验分组：无牵伸对照组(Ctrl),无牵伸对照加雷帕霉素组(Ctrl+Rapa),低幅度牵伸组(LE),低幅度牵伸加雷帕霉素组(LE+Rapa),高幅度牵伸组(HE),高幅度牵伸加雷帕霉素组(HE+Rapa)3.2.2不同牵伸强度及雷帕霉素干预对跟腱异位骨化的影响各组大鼠右侧跟腱免疫组化染色显示,Ctrl+Rapa组跟腱细胞RUNX2和OSX蛋白表达量较Ctrl组显著下降(P<0.05)；LE+Rapa组跟腱细胞RUNX2和OSX蛋白表达量较LE组显著下降(P<0.05)；]HE+Rapa组跟腱细胞RUNX2和OSX蛋白表达量较HE组显著下降(P<0.05)。总结本研究采用Flexcell FX-5000应力加载系统,选用4%、12%牵伸应变量,每天牵伸8小时,模拟反复机械牵伸所导致肌腱病的慢性损伤过程,观察肌腱干细胞在不同牵伸状态下成骨分化的情况。此外,加入mTORC1特异抑制剂雷帕霉素,观察mTORC1被抑制后机械应力对跟腱干细胞成骨分化的影响。我们发现,雷帕霉素加强了4%机械牵伸抑制跟腱干细胞成骨分化的作用；同时,雷帕霉素也减弱了12%机械应力促进跟腱干细胞成骨分化的作用。在动物实验中,构建了承受不同机械应力的大鼠模型,用腹腔注射雷帕霉素的方法抑制mTORC1信号通路。结果发现,雷帕霉素加强了低幅度机械牵伸抑制跟腱异位化的作用；同时,雷帕霉素也减弱了高幅度机械应力促进跟腱异位骨化的作用。细胞实验结果与动物实验结果相一致,说明机械应力通过mTORC1信号通路调节跟腱干细胞的成骨分化以及肌腱的异位骨化。低幅度的机械牵伸可以抑制跟腱干细胞的成骨分化和肌腱的异位骨化,这发现可能可以指导我们在临床中对于肌腱病的治疗。此外,雷帕霉素通过直接抑制mTORC1也可发挥抑制跟腱干细胞的成骨分化和肌腱异位骨化的作用,因此,雷帕霉素可能可以作为一种新的肌腱病的治疗药物。