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研究背景：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种以黑质致密部多巴胺能神经元变性、坏死为主要病变的神经系统疾病,典型临床症状为静止性震颤(resting tremor)、肌肉僵直(muscular rigidity)、运动迟缓(bradykinesia),同时约半数以上的PD患者,在晚期会出现起步困难、姿势不稳、步态紊乱等轴性症状(Postural instability/gait disorder, PIGD),而这种轴性症状严重的影响了患者的生活质量,虽然传统的核团毁损术、多巴胺药物替代治疗及高频电刺激苍白球内侧部、丘脑底核或丘脑腹侧核均可改善病人典型症状,但是对病人出现的轴性症状疗效甚微。Plaha P及其同事在2005年首次报道了低频电刺激(low frequency stimulation,LFS)脚桥核(pedunculopontine nucleus,PPN,在鼠类相当于脚桥被盖网状核,pedunculopontine tegmental nucleus,PPTg,)可明显改善PD病人的步态紊乱、姿态不稳等PIGD症状,同时有研究表明,PD状态下,PPN的神经元会发生不同程度变性、凋亡以及残余神经元出现不规则放电、代偿性地异常过度放电；这些都提示PPN不仅在PD发病过程中起着重要作用,而且PPN可能参与运动功能的调节,并且这种运动功能的调节可能同PIGD症状相关。随后PPN作为一种新的靶核团受到人们越来越多的关注。大量临床研究已证实低频电刺激PPN可改善PD病人姿势不稳、步态紊乱等PIGD症状,但是对于其作用的机理尚不明确,而低频电刺激PPN对动物行为学影响的研究较临床研究的滞后性,使得阐明这种作用机理愈发困难,因此通过动物实验探讨低频电刺激PPN对行为学的影响是极为重要的。单侧注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)同时在特定的神经核团植入电极的偏侧PD大鼠模型具有可重复性,稳定性特点,这种模型已被证实可作为研究深部电刺激丘脑底核对PD大鼠行为学影响的一种理想的动物模型。虽然有大量的行为学方法用于检测偏侧PD大鼠行为学的改变(如BBB评分、足迹实验,爬梯实验及平衡木实验)但这些实验所得数据存在较大的人为主观性,所得结论有待进一步商榷,因此在行为学检测中尽量客观的行为学检测方法及指标是极为重要的,本实验拟采用的Catwalk步态检测系统及旷场实验(open field test),是相对理想的两种行为学检测方法,它们极大避免了人为因素对动物行为学的影响,并且这两种检测方法已被广泛的用于脊髓损伤、脑缺血、PD等动物模型行为学得检测,已经得到了越来越多的学者的认可。目的：本研究拟采用Catwalk步态检测系统和旷场实验评估低频电刺激脚桥被盖网状核对6-OHDA所致偏侧PD大鼠行为学的影响,为深入研究低频电刺激脚桥核治疗晚期PD提供理论基础。方法：1.动物分组：32只SD大鼠按完全随机数字表法将其分为对照组(6-OHDA组,n=8)、实验组(6-OHDA电极植入组,n=24)。2.立体定向手术及电极植入大鼠腹腔注射3.6%水合氯醛(100g/ml)麻醉后,固定于立体定向仪上,常规消毒,剪开头皮,剥离骨膜,暴露颅骨,将颅骨前后囟调平。根据Paxinos and Watson的《大鼠脑立体定向图谱》确定右侧前脑内侧束(medial forebrain bundle,MFB)和PPTg坐标(MFB:AP:-1.8mm, ML:-2.1mm, DV:-8.3mm。PPTg: AP:-7.9mm, ML:-2.1mm, DV:-7.0mm),用10μL微量进样器在MFB处注射新鲜配置的含0.02%抗坏血酸盐的6-OHDA溶液(4μL/10μg),随后在显微镜下将8导钨丝刺激电极(每根电极尖端直径为50μm)植入PPTg,用60°左右生理盐水洗脱电极,牙科水泥固定并堆积成电极连接的平台(headstage)。对照组仅在MFB处注射6-OHDA,骨蜡覆盖钻孔,缝合皮肤。各组大鼠在术后一周恢复期内自由饮食饮水；两周后自由饮水,每日进食量限制在10g左右,以控制体重。3.PPTg-LFS大鼠头部刺激电极通过导电滑环与刺激隔离器输出端连接,刺激器输出端的电缆套上金属螺旋管,以防刺激过程中大鼠对电缆造成损坏。从8导刺激电极中筛选出两根最有效的电极作为刺激的正负极。刺激参数：单脉冲,方波,频率25Hz,波宽80μs,幅值2-8V。每只大鼠的刺激幅值为个体刺激阈值的80%。每只大鼠从2V开始给予刺激,以0.1V为单位向上调,刺激时间少于10s,相邻刺激间隔至少间隔1min,直到出现刺激副作用时(比如,大鼠胡须直立、头部抖动等)的幅值为个体的刺激阈值。4.行为学检测所有大鼠在立体定向手术前1周进行Catwalk及旷场实验数据采集作为行为学基线值,术后21天后所有大鼠再行Catwalk及旷场实验数据采集,术后四周后6-OHDA电极组行PPTg-LFS时,再次采集行为学数据。(1)旷场实验：所用装置为：直径80cm,高50cm,由工程塑料合金合成的圆柱形矿场反应箱(荷兰Noldus公司)。将大鼠放在反应箱的中央部,保持周围的环境安静,光线适中,大鼠先适应环境10min后,记录5min内大鼠移动的距离、运动轨迹及速度。(2)Catwalk步态采集：Catwalk步态分析系统是一种自动化的计算机辅助的步态分析技术,它主要由内置荧光灯的玻璃板、高频摄像头组成。当大鼠通过玻璃板时,荧光会从底部反射出爪印的形状,被下方的摄像头捕捉到,传送到计算机,进行离线分析。大鼠适应性训练一周以后开始记录数据,记录标准为大鼠连续的、不间断的通过通道,并且每次通过至少有10步,每只大鼠至少记录三次。5.免疫组化及尼氏染色(Nissle)行为学检测后,大鼠腹腔麻醉,将刺激电极通过牙科水泥固定形成的平台与刺激器相连,给予高于个体阈值的电压通电,使得电极尖端在脑组织上留下氧化后的痕迹,以确定刺激电极的尖端的位置。随后对大鼠开胸,经左心室穿刺入主动脉进行灌注固定：先用0.9%的生理盐水300ml预灌注,再用4%多聚甲醛溶液300m1固定,断头并完整取出脑组织,置于4%的多甲溶液中24小时后,再置于30%的蔗糖溶液中,直至脑组织完全下沉。将固定脱水后的脑组织行冰冻切片,片厚约25μm,取黑质致密部行络氨酸羟化酶免疫组化染色,脚桥核行尼氏染色。6.统计学分析采用spssl7.0进行数据分析。计量资料用均数±标准差(x±S),所有大鼠术前同术后均数比较采用配对样本t检验；6-OHDA电极植入组在PPTg刺激前、后的计量资料比较采用配对样本t检验,实验组和对照组间比较采用独立样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1. Catwalk检测结果：所有大鼠术后的速度变化百分比(run speed variation)、双爪耦合(Couplings,右前→左前,右前→左后,右后→左前,右后→左后)较术前明显增加,每秒步数(Cadence)明显减少,6-OHDA电极组大鼠行LFS-PPTg时速度变化百分比及双爪耦合(右前→左前,右前→左后,右后→左前,右后→左后)较术后显著下降,每秒步数较术后增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.旷场实验检测结果：所有大鼠术后运动距离较术前明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),实验组(6-OHDA电极组)行LFS-PPTg时,运动距离较术后有所增加,且差异显著(P<0.05)。3.实验组和对照组行为学比较：立体定向术前,实验组同对照组所有大鼠在旷场实验和Catwalk步态检测所得的行为学数据无差异(P>0.05)；术后未行电刺激前实验组同对照组相比也无差异(P>0.05)。结论：低频电刺激脚桥被盖网状核后,PD大鼠的运动能力及一些反应临床上PD轴性症状的步态的到改善,说明偏侧PD大鼠PPN植入电极的模型同Catwalk及旷场实验结合,能很好的反应PD轴性症状和运动能力的改变。这为进一步研究LFS-PPN作用机理提供了很好的行为学基础,因此这种行为学同进一步的病理生理及同步记录相关神经元的电生理活动相结合,可能会为LFS-PPN作用机理提供新的理论基础,从而推动LFS-PPN在临床的广泛应用,使饱受轴性症状困扰的病人不再深受其害。