研究目的:乳腺癌是我国妇女最常见的恶性肿瘤,近年来患病人数逐年升高,已成为女性生命健康的严重威胁。在过去的几十年里,由于先进的筛查手段和辅助治疗,乳腺癌的死亡率已经开始下降,但一些患者仍然有很高的复发风险,并且预后很差。然而,目前乳腺癌发生发展的分子机制尚未完全阐明,这限制了乳腺癌患者的个体化诊疗及预后评估。因此,探索乳腺癌致癌过程中的相关信号分子,深入阐明乳腺癌发生发展的机制,仍是防控乳腺癌的重要前提。嗅觉受体ORs(olfactory receptors)属于G蛋白偶联受体家族成员,最初发现定位于嗅觉神经元上,在机体识别气味过程中发挥着关键作用。近年来有研究发现ORs可异位表达于睾丸、肝脏、脂肪、肾上腺、肾脏、心脏等一些非嗅觉器官及组织中,并与前列腺癌、结肠癌、肺癌、黑色素瘤以及白血病等肿瘤的发生发展相关。另外研究发现ORs在恶性肿瘤中所起的生物学作永并不一致,同一OR受体在不同肿瘤中甚至扮演着促癌或抑癌的“双重角色”。ORs在乳腺癌中的表达也有少数报道,在伴有CHEK2基因11OOdel C截断突变的乳腺癌中,发现有34个OR基因的表达明显升高。另外,大样本乳腺癌数据分析显示,多个OR分子在乳腺癌组织及细胞中存在大量的扩增,并发现来源于同一嗅觉受体家族的多个分子如OR2B6、OR2W3、OR2T8存在异常高表达。这提示ORs可能为一种乳腺癌潜在的生物标志物。此外,有研究报道:ORs与乳腺癌细胞的DNA甲基化异常有关,可能诱导肿瘤细胞产生他莫昔芬耐药性。这些发现提示ORs在乳腺癌进展中发挥一定的作用。然而,目前关于ORs的表达对乳腺癌细胞生物学功能的影响及其具体调控机制鲜有报道,阐明ORs在乳腺癌中的功能及其相关机制对乳腺癌的诊断与治疗有着重要意义。我们课题组前期利用高通量mRNA表达谱芯片对比了肿瘤的转移组与非转移组中差异表达的mRNA,在其中发现OR2T6(the olfactory receptor family 2,subfamily T,member 6)的mRNA水平在转移组的表达明显高于非转移组。然而,目前关于OR2T6在肿瘤中所发挥的作用以及相关机制尚未明了。本研究中我们检测了新鲜的乳腺癌及正常乳腺组织中的OR2T6 mRNA水平,并利用免疫组织化学方法检测了 OR2T6在102例乳腺癌石蜡包埋组织及60例正常乳腺组织中的表达,分析了其与乳腺癌患者的预后及临床病理学参数之间的关系。在体外实验中,我们通过EdU、Transwell、流式细胞学技术研究了 OR2T6对乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移及上皮-间叶转化(EMT)的影响。为了探讨OR2T6促进乳腺癌细胞增殖并抑制凋亡的具体分子机制,我们通过高通量mRNA表达谱芯片筛选、实时荧光定量PCR及Western blot初步验证了 OR2T6对MAPK/ERK信号通路的调控作用。研究方法:1.收集41例新鲜乳腺癌及9例正常乳腺组织,应用实时荧光定量PCR检测OR2T6 mRNA在两组样本中的表达。2.收集102例乳腺癌及60例正常乳腺组织石蜡标本,应用免疫组织化学方法检测OR2T6蛋白在两组样本中的表达,并分析其与临床病理学参数之间的关系。3.绘制Kaplan-Meier生存曲线并应用log-rank检验对OR2T6表达阳性和表达阴性的两组乳腺癌标本进行生存分析,探讨OR2T6的表达对乳腺癌患者总体生存率及无病生存率的影响。应用Cox回归分析探讨OR2T6与乳腺癌患者预后的关系。4.查询cBioPortal癌症基因数据库中的多个乳腺癌研究数据,综合分析OR2T6基因在乳腺癌中的遗传学变化。5.将pcDNA3.1-OR2T6过表达质粒和OR2T6 siRNA分别转染乳腺癌细胞系,应用EdU实验和流式细胞技术检测OR2T6对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖、凋亡功能的影响。6.将pcDNA3.1-OR2T6过表达质粒和OR2T6 siRNA分别转染乳腺癌细胞系,应用Transwell实验检测OR2T6对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞侵袭、迁移能力的影响。7.将pcDNA3.1-OR2T6过表达质粒和OR2T6 siRNA分别转染乳腺癌细胞系,应用Western blot实验方法验证OR2T6在乳腺癌细胞发生上皮细胞-间叶转化(EMT)过程中可能发挥的调控作用,进一步探讨OR2T6对乳腺癌细胞侵袭、迁移生物学功能的影响。8.收集干扰OR2T6基因和阴性对照组乳腺癌MCF-7细胞进行mRNA基因表达谱检测,筛选差异表达基因,应用 DAVID(Database for Annotation,Visualization,and Integrated Discovery)线上工具对筛选出的差异基因进行GO和KEGG信号通路富集分析,分析可能受OR2T6调控的下游信号通路,并通过实时定量PCR和Western blot实验方法进一步验证。结果:1.OR2T6在乳腺癌组织中的表达:实时荧光定量PCR检测结果显示,OR2T6 mRNA在41例新鲜乳腺癌组织中的表达明显高于9例正常乳腺组织。应用免疫组化实验结果发现,与60例正常乳腺石蜡组织标本相比,102例乳腺癌石蜡标本中OR2T6的蛋白表达明显升高。2.OR2T6蛋白表达与乳腺癌临床病理学参数之间的关系:应永卡方检验和Fisher精确检验统计方法分析发现,OR2T6蛋白的阳性表达与乳腺癌患者的淋巴结转移及较高的TNM分期有关,与患者年龄、肿瘤大小及组织学分级无关。3.OR2T6表达与乳腺癌患者预后的关系:Kaplan-Meier生存曲线及log-rank检验显示OR2T6阳性表达的乳腺癌患者总体生存时间和无病生存时间更短,预后更差。单因素及多因素Cox回归分析进一步提示OR2T6阳性表达与淋巴结转移、TNM分期是影响乳腺癌患者预后的危险因素,但OR2T6不能做为一个独立的预测预后的危险因子。4.cBioPortal癌症基因数据库中乳腺癌OR2T6基因的遗传学变化:在cBioPortal中综合分析10项乳腺癌研究发现,在8023例乳腺癌患者中,平均有9.21%的患者OR2T6基因发生了遗传学变化,其中734例为基因扩增,5例为基因突变,4例出现基因缺失。5.OR2T6对乳腺癌细胞增殖、凋亡作用的影响:在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中转染OR2T6过表达载体后发现,乳腺癌细胞增殖能力明显增强,细胞凋亡能力减弱。敲除OR2T6的表达后,乳腺癌细胞增殖能力减弱,凋亡能力增强。6.OR2T6对乳腺癌细胞侵袭、迁移能力的影响:在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中转染OR2T6过表达载体后发现,乳腺癌细胞迁移及侵袭能力明显增强,干扰OR2T6的表达后,迁移及侵袭能力减弱。7.OR2T6在乳腺癌细胞EMT过程中的调控作用:在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中转染OR2T6 cDNA后发现,EMT过程中上皮标志物E-cadherin表达水平降低,间充质标志物N-cadherin、Vimentin、β-catenin的表达升高;干扰 OR2T6 的表达后,E-cadherin 表达升高,N-cadherin、Vimentin、β-catenin的表达降低。这提示OR2T6可促进乳腺癌细胞发生EMT,进一步证实OR2T6可增强乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力。8.OR2T6促进乳腺癌细胞增殖、抑制凋亡的机制研究:在乳腺癌MCF-7细胞中干扰OR2T6表达,对比干扰前后基因表达谱的变化结果显示:在28186个检测基因中有13452个基因表达上调,14734个基因表达下调。其中倍数变化>2以上的差异表达基因(DEGs)有385个,在这些差异表达基因中,213个基因表达上调,172个基因的表达下调。将差异基因进行GO和KEGG信号通路富集分析发现,差异表达基因主要集中在调节生物过程、细胞对化学刺激的反应和生物粘附等方面,并富集在cAMP、钙离子信号通路和RAP1、PI3K-AKT、Ras信号通路等肿瘤相关通路中。实时荧光定量PCR实验发现干扰OR2T6的表达后,MAPK/ERK信号通路中的H-Ras、c-Myc、ERK和c-fos基因的mRNA水平降低。Western Blot实验进一步证明,敲除OR2T6基因的表达时,上述基因的蛋白表达水平明显减少。这些结果表明,OR2T6可能参与调控MAPK/ERK信号通路,并可能通过调控该通路促进了乳腺癌细胞的增殖并抑制细胞凋亡。结论:1.OR2T6 mRNA及蛋白在乳腺癌组织中的表达均明显高于正常乳腺组织,OR2T6蛋白的阳性表达与淋巴结转移、高的TNM分期有关,与患者年龄、肿物大小及组织学分级无关。OR2T6阳性表达与乳腺癌患者预后不良相关。2.OR2T6可促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移,并可抑制乳腺癌细胞的凋亡。3.OR2T6可能通过促进乳腺癌细胞发生EMT,进一步增强了乳腺癌细胞的侵袭迁移能力。4.OR2T6可能参与调控MAPK/ERK信号通路,并可能通过调控该通路促进了乳腺癌细胞的增殖并抑制细胞凋亡。