皮质发育障碍(DCDs)是难治性癫痫(IE)的主要病因之一。本课题组在前期研究中先后建立了冰冻损伤 P0乳鼠脑获得的局灶性 DCDs模型、对孕17d母鼠予以γ射线照射和注射卡莫司汀获得的 F1代仔鼠的弥漫性DCDs模型。通过对模型鼠的组织病理学研究发现不论建模方法是否损伤海马，也不论模型鼠是否发生癫痫，在模型鼠海马CA3区都会出现苔藓样纤维芽生的现象。该现象与人类皮质发育不良并发癫痫患者手术切除脑组织标本的病理研究发现相似。海马苔藓样纤维芽生是轴突芽生的一种，是局部神经回路重构（neural network reform）和突触重塑（synaptic reorganization）的重要征象，提示模型鼠大脑内发生了神经回路重构，而这种改变正是导致IE的主要病理机制。过去的研究已发现十余个基因突变与DCDs的发生有关、推测这些改变可能导致了DCDs患者IE的形成。但是，迄今为止对皮质发育障碍诱发癫痫发作的核心病理改变和分子机制仍然所知不多。本研究选择高能X射线照射孕鼠的方法建立DCDs大鼠模型，对模型鼠进行行为学观察、电生理学、认知功能检测、组织病理学检查、疾病相关基因筛查、并利用生物信息学方法对主要差异基因进行分析和实验验证等，以探索DCDs诱发癫痫发作的核心病理改变和潜在的分子机制。　　本研究共分四个部分。　　第一部分：X射线照射法建立弥漫性皮质发育不良大鼠模型　　目的：探索用X射线照射孕鼠建立子代大鼠能模拟人类弥漫性皮质发育不良的模型，确定建模的方法和最佳照射剂量。　　方法：利用医用直线加速器产生的高能X射线照射妊娠16天SD孕鼠。健康孕鼠被随机分配到高、中、低3个不同的照射剂量组。低剂量组照射剂量为145cGy，中剂量组的照射剂量为175cGy，高剂量组照射剂量为200cGy。孕鼠分娩产下的仔鼠即为F1代大鼠。通过对各组模型鼠进行行为学观察、认知功能和学习能力检测、脑电图检查、致痫性实验和病理学研究等，判定 F1代大鼠有无弥漫性皮质发育不良。　　结果：　　1、使用不同照射剂量（145cGy、175cGy、200cGy）照射妊娠期孕16d母鼠均会诱发胚胎鼠中枢神经系统的发育畸形。随着照射剂量的增加，中枢神经系统的损害严重程度也增加，两者呈现近似线性的剂量依赖关系。　　2、低剂量组（145cGy）大鼠出生存活率高，与正常对照组相比无差别，无自发性癫痫样抽搐，无认知功能改变，脑电图未见自发性癫痫样脑电活动。病理学改变以皮质厚度变薄为主，可见少量皮质下异位结节。　　3、中等剂量组（175cGy）大鼠出生存活率与正常对照组相比无差别；12.5%的F1代仔鼠发生了RacineⅠ至Ⅱ级自发性癫痫样抽搐，脑电图检测有少量的尖波和尖慢波出现；学习记忆能力降低，但随着训练次数的增多而逐渐达到正常；病理研究可见典型的皮质变薄、皮层下异位结节、海马CA1区异位结节。　　4、高剂量组（200cGy）出生27只F1代仔鼠，死亡2只，存活率92.59%；12%的 F1代仔鼠发生了RacineⅠ至Ⅱ级自发性癫痫样抽搐，脑电图可见大量自发性尖波、棘波、尖慢波等典型的自发性癫痫样放电活动出现；学习记忆能力降低，虽经反复训练在第4天和第5天寻找平台的潜伏期仍然比对照组延长，差异显著(P＜0.05)。病理学检查显示皮质变薄程度、皮层下异位结节数量以及海马组织改变程度较中、低剂量组更为严重。高剂量组F1代大鼠行动迟缓、动作笨拙，在训练第一天和第二天曾出现溺水现象，其余各组均未出现类似现象，结果提示高剂量组F1代大鼠存在明显的运动功能受损。　　5、Timm’染色显示双侧海马CA3区苔藓纤维发芽，其出芽纤维主要向锥体细胞层走行，见于锥体细胞层（pyramidal cell layer, PCL）、下锥体细胞层（stratum oriens,SO），而齿状回上颗粒区尖端到嵴之间或内分子层（inner molecular layer, IML）未见Timm嗜银颗粒。　　6、GABA免疫组织化学反应结果：GABA免疫阳性神经元表达为（137±31个）较正常对照组（223±24个）减少显著，差异有显著性(P＜0.05)。　　结论：　　1、使用医用直线加速器发生的X射线照射孕16d母鼠能诱导其子代大鼠脑损伤，其行为学、电生理学、认知功能损害和组织病理学表现均类似人类弥漫性皮质发育不良；2、中、高剂量组仔鼠有自发性癫痫样发作和痫样放电，用175cGy的X射线剂量照射建模为最佳剂量。　　第二部分：弥漫性皮质发育不良疾病相关基因的初步研究　　目的：探索弥漫性DCDs模型鼠的相关基因改变，筛选导致DCDs形成和致难治性癫痫的可能相关基因　　方法：使用X射线175cGy的剂量照射妊娠16天母鼠建模。收集出生0天(P0)F1代仔鼠和正常对照组仔鼠皮质、海马组织，使用Trizol法提取总RNA，逆转录cDNA后用Affymetrix RAT2302.0基因表达谱芯片检测。实验设计重复两次，以减少假阴性和假阳性结果对真实结果的干扰。　　结果：　　1.与对照组比较，模型鼠共得到54个差异基因或检测位点，其中3个上调，51个下调。排除有编号无注解的转录位点，经过两次重复校正的射线组-对照组差异基因为39个，其中2个上调，37个下调。　　2.重点研究了下调基因Signal Ratio小于-1的4个基因。它们是Rn.23189(Dyrk2)，Rn.52518(Dhx36)，Rn.15120(Rrs1)和Rn.128628(Adam10)，通过生物信息学得知这些下调的基因所执行的功能涉及DNA和染色体的损伤修复、遗传信息的转录、mRNA代谢，APP代谢以及细胞凋亡等数个与细胞周期运行密切相关的过程。这与第一部分实验中观察到模型鼠存在学习记忆障碍，存在自发性癫痫样抽搐等行为改变相符合；与病理研究观察到异位神经结节、海马苔藓样纤维出芽等现象相符合。　　3.仅有的2个上调基因是Rn.19780(MT-protocadherin)和Rn.9944(STX1B)。STX1B基因编码的蛋白主要发挥调节神经递质代谢的生理功能，而MT-protocadherin基因的功能尚不清楚。　　结论：　　1、用 X射线照射孕鼠所诱导的子代鼠 DCDs形成的机制与Rn.23189(Dyrk2)，Rn.52518(Dhx36)，Rn.15120(Rrs1)和Rn.128628(Adam10)受损、细胞代谢紊乱、遗传信息转录异常有关。　　2、X射线照射孕鼠所诱导的子代鼠DCDs形成模型中并发癫痫的现象可能与STX1B蛋白参与的突触传递的兴奋性通路有关。　　3、MT-protocadherin（PCDH21）基因在DCD模型鼠皮质、海马内异常表达，可能与 DCD或者并发癫痫的潜在机制有关。其生理、病理功能有待进一步研究。　　第三部分：PCDH21的结构蛋白质组学研究　　目的：使用蛋白质结构预测和功能预测的策略和方法，分析PCDH21蛋白的结构、预测可能的功能和相互作用靶蛋白。为进一步了解PCDH21基因及其编码蛋白在DCD形成机制中的作用为开展进一步实验寻找方向。　　方法：使用NCBI-Protein、EBI和SWISS数据库及其附带分析软件获取PCDH21蛋白的序列、氨基酸组成，分析疏水性、跨膜区及其方向、motif组成和结构域数据，通过同源模建等蛋白质结构预测方法以及同源进化分析，预测PCDH21的功能。结合第一、第二部分实验的结果，推测在DCD并发癫痫模型鼠中可能发挥的生理、病理作用。　　结果：　　1、PCDH21蛋白由859个氨基酸组成，分子量为93763.93，蛋白质等电点（PI）5.34。在组成PCDH21蛋白的氨基酸中Val比例最高（9.662%）。PCDH21的GRAVY值等于-0.7，这说明该蛋白属于亲水性蛋白。　　2、利用 TMPRED数据库，通过 PCDH21蛋白跨膜区分析，发现PCDH21蛋白N-末端位于细胞外。N端4-27位的氨基酸序列和702-726位的氨基酸序列得分最高。数据提示 PCDH21蛋白序列可能是在702-726位由内向外跨膜，细胞外段弯曲后4-27位的氨基酸再由外向内嵌入细胞膜。　　3、PCDH21蛋白motif分析，结果显示细胞内段未发现motif，细胞外段有6处 motif与 cadherin-2相同，2处与 cadherin-1相同。经NCBI/Protein数据库检索，cadherin-2就是神经组织来源钙粘蛋白（N-cadherin），cadherin-1是表皮来源的钙粘蛋白（E-cadherin）。　　4、对PCDH21蛋白质序列的分析显示细胞外段21和22位点之间是剪切的部位。剪切后的片段以信号肽的形式存在的可能性为0.987。　　5、结构域分析显示PCDH21蛋白具有两个跨膜区，6个CA结构域和3个SEG低复杂区。CA结合域在Ca2+介导下发挥细胞粘附和连接的功能。　　6、同源性分析可以发现 PCDH21与 protocadherin LKC(protocadherin24)距离最接近，其次与cadherin19、cadherin20较接近，再次与protocadherin19和cadherin23距离较接近。　　7、对PCDH21三级结构预测，通过 SRS搜索，没有得到GFAP的PDB文件，说明此蛋白的三维结构还没有解析出来。所以在PCDH21蛋白三级结构预测中，按照同源模建的预测策略，在数据库中按照相似程度的高低自动选择两个模板。Cd00031模板为 N-cadherin，pfam00028为E-cadherin。　　结论： PCDH21为一种亲水性的膜蛋白，N端在细胞外C端在内。PCDH21蛋白可能为一种弯曲状态，其细胞外端在第702位氨基酸处由细胞内向细胞外跨膜穿出，穿出后的肽链其N端折返向细胞膜，在1-24位的氨基酸由外向内再次穿过细胞膜形成短小的跨膜区。N端氨基酸序列第21位和22位间为剪切位点，PCDH21蛋白活化时能在此处被剪切，激活PCDH21蛋白并产生有一段信号肽。　　PCDH21蛋白的motif和结构域均与N-cadherin相似，同源模建结果显示PCDH21与N-cadherin同源性性大于60%。这些结果都支持PCDH21与N-cadherin的生理功能非常相似，可以借鉴N-cadherin研究的结果。在DCD伴发癫痫的模型鼠中PCDH21可能发挥了与钙离子结合介导同类神经元粘附，突触形成，以及神经回路构建的功能。　　第四部分：PCDH21与弥漫性皮质发育不良机制研究　　目的：了解抑制PCDH21异常表达对DCD模型鼠体外培养神经胶质细胞行为学和形态学的影响。了解抑制PCDH21在DCD模型鼠皮质、海马内表达，对组织病理破坏严重程度和时序性的的影响。用实验数据检验第三部分理论实验的准确性，诠释“DCD模型中异位灶以及异常神经回路形成的分子基础是什么？”这一核心问题。　　方法：2只妊娠16天母鼠，使用X射线175cGy的剂量照射建模为实验组，设立2只不接受任何处理的妊娠16天母鼠为对照组。实验组和对照组各选择其中1只母鼠所产全部仔鼠，出生0天收集仔鼠的皮质和海马进行神经胶质细胞体外培养。　　人工合成PCDH21-siRNA基因序列，添加酶切位点和转录终止序列，经退火处理形成双链后插入真核表达载体pGenesil-1中，经酶切鉴定证实后构建成为PCDH21真核表达载体。使用Lipofectamine2000瞬时转染体外培养的神经胶质细胞。设转染组、未转染组和正常对照组，运用 MTT法检测细胞增殖，RT-PCR和 Westernblot方法检测检测抑制PCDH21表达对DCD模型鼠神经胶质细胞行为学的影响。使用HE染色、Nissle染色方法检测抑制PCDH21表达对细胞形态学的影响。　　选择6只实验组仔鼠，于出生第三天使用EntransterTM-in vivo，用侧脑室注射方法进行体内试验。使用 HE染色、Nissle染色方法检测抑制PCDH21表达对组织病理破坏严重程度和时序性的的影响。　　结果：　　1、应用MTT实验，我们观察到与未转染细胞和正常对照相比，转染PCDH21-siRNA1的神经胶质细胞在体外的增殖减缓　　2、转染前可见神经胶质细胞生长旺盛，互相重叠，相互间形成大量的联系。选择抑制效果最好的siRNA1组转染体外培养的神经胶质细胞。在转然后24小时可见细胞密度下降，细胞间联系减少，胶质细胞由多角形向梭形转变。转染48小时这种变化趋势更加明显。该结果提示抑制PCDH21的过渡表达会降低神经细胞聚集。在Nissl染色条件下，可以见到单个神经胶质细胞的突触数量的显著减少。　　3、在DCD模型鼠出生第三天向侧脑室注射si-RNA质粒后观察到①接受转染处理的DCD模型鼠病理变化被延迟了21天。②接受转染处理的DCD模型鼠病理变化严重程度显著低于未转染组　　结论：　　①抑制 PCDH21表达能降低模型鼠神经胶质细胞的增殖。②抑制PCDH21表达能使模型鼠神经胶质细胞间突触联系减少。③抑制PCDH21表达能使模型鼠神经胶质细胞形态由多角形向梭行转变。这些变化均以未转染的模型鼠神经胶质细胞和正常神经胶质细胞为对照，并且这些表形的变化与抑制效率有关。在体实验结果显示，①抑制 PCDH21表达能使模型鼠海马组织破坏、异位神经结节出现的时间延后了。②抑制PCDH21表达能减少GABA阳性神经元的丢失。这些结果说明，抑制PCDH21的异常高表达不仅能影响神经胶质细胞的生长，而且能影响到皮质海马内组织病理变化出现的时间和严重程度。因此我们推测在神经胶质细胞的增殖、迁移和组织损伤修复等DCD发生和进展多方面，PCDH21确实与之相关，并且有可能是一个起重要作用的调控基因。