光散射是一类常见的物理现象,颗粒的散射光一直是反映颗粒特性的重要参数。颗粒对光的散射能力取决于颗粒的粒径、材质以及形状,光散射技术通过分析散射光的强度,能够实现对颗粒性状的表征。基于单颗粒的光检测技术应用广泛,光散射技术由于具有方便、快速、准确等优势,主要应用于实现粒径的表征,而仪器检测的散射光强并不完全决定于颗粒的粒径,还受到颗粒与仪器等各类参数的影响,导致难以实现对粒径的精确表征。为了预测颗粒的光散射能力和解释常见的光学现象,Mie散射理论及其相关的数值模拟体系相继发展。根据Mie散射理论,特定仪器参数下测得的散射光强为一系列光散射参数的综合结果,光散射参数囊括颗粒的粒径、颗粒的形状与取向、颗粒与周围介质的折射率、仪器的收集角与收集范围、入射光的波长与偏振状态等。Mie散射模型作为一种单颗粒的散射光强计算体系,已经被广泛应用于粒径表征、气象模拟、光学医疗诊断、环境监测等各个领域,在单颗粒水平上验证Mie散射理论的正确性尤为重要。基于单个颗粒的散射光实验证实了颗粒粒径、入射光偏振状态对散射光强的影响,颗粒散射光强分布的角度依赖性也得到证实,但这些研究并没有综合所有的光散射参数进行验证,且对Mie理论的单颗粒验证也仅局限于微米粒径范围。与不断发展的Mie理论与数值模拟相比,对Mie理论的单颗粒验证显得相对滞后,这主要存在两方面的原因,一是缺乏足够灵敏的单颗粒散射光检测技术,二是缺少成熟的纳米尺寸粒径标准品合成体系。在单颗粒水平验证Mie散射理论对于微米粒径以下颗粒(纳米微球)的正确性,对颗粒粒径的准确表征与散射光强的准确预测都具有重要的意义。流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种对细胞大小的颗粒在单颗粒水平进行快速定量分析的多参数检测技术。FCM检测的散射光信号能够揭示细胞的理化性质,荧光信号则用于实现蛋白或核酸组分的定量分析。由于散射光检测灵敏度的限制,传统的流式细胞仪对于低折射率生物颗粒的检测限通常为300 nm-500 nm。通过减小探测区体积、延长颗粒穿越激光探测区的时间、隔绝光窗背景散射、提高激光功率密度等措施,我们课题组研制成功了具有自主知识产权的超高灵敏流式检测装置(High Sensitivity Flow Cytometer,HSFCM),仪器的散射光灵敏度相比于传统FCM提高了 4-5个数量级,能够实现24 nm无机纳米颗粒(二氧化硅纳米颗粒)与27 nm生物纳米颗粒(MS2病毒)的单颗粒散射光检测。另外,我们发展了粒径均一的二氧化硅纳米微球合成新方法,能够实现20 nm-1000 nm二氧化硅纳米微球的可控合成。基于HSFCM对于纳米颗粒散射光的高灵敏度检测特性,我们以二氧化硅纳米微球为粒径标准品,构建Mie散射理论计算模型作为理论对比,在单颗粒水平上验证颗粒粒径、入射光偏振、颗粒折射率对散射光强的影响;以粒径均一的T7噬菌体和T7空壳为生物模型,建立一种对生物纳米颗粒的单颗粒水平折射率测定新方法;通过构建外膜-内腔折射率模型,在无染料标记、无需破坏生物颗粒结构的前提下,实现对生物颗粒内腔组分浓度的精确定量。结合HSFCM对于纳米微球荧光的高灵敏检测特性,在单颗粒水平对颗粒的荧光偏振进行研究,规避荧光偏振对荧光定量的影响,实现颗粒荧光当量(每个颗粒上的等效可溶性荧光分子数目,MESF)的精确表征。本论文的研究方向包含以下方面:第一章为文献综述。介绍常用的散射光强的单颗粒检测技术,以及如何利用光强实现粒径的表征方法。介绍折射率匹配在基于散射光强度的颗粒粒径表征中的重要性以及颗粒折射率的测定方法,并简述本论文的选题思路和研究内容。第二章为Mie散射理论的单颗粒水平亚微米尺度的实验验证。我们发展了粒径均一可控的二氧化硅纳米微球合成的新方法,制备了一系列纳米微球粒径标准品,颗粒粒径为180 nm-880 nm。借助于成熟的Mie计算软件,综合考虑所有的光散射参数,构建了 Mie散射光强计算模型。基于HSFCM对纳米颗粒散射光的高灵敏度检测特性,将其应用于二氧化硅纳米微球的散射光分析,在单颗粒水平上验证了散射光强与粒径的相互关系。通过改变入射光的偏振状态,考察了二氧化硅和聚苯乙烯等不同材质纳米微球的散射光强变化趋势,进一步验证了入射光偏振方向以及折射率对散射光强的影响。HSFCM在单颗粒水平上的测定结果,无论在颗粒散射光强大小或者变化趋势都与Mie散射理论预测非常一致。基于Mie散射理论的准确性,我们分别预测了不同材质颗粒在商品化FCM上的散射光强变化趋势。第三章为生物纳米颗粒的折射率测定及其内腔组分浓度的精确定量。我们以粒径相近折射率不同的T7噬菌体和T7空壳为模型,基于HSFCM对纳米颗粒散射光检测的高灵敏度,我们在单颗粒水平验证了折射率对颗粒散射光强度的重要影响。结合HSFCM的颗粒散射光强度测定与Mie散射理论的散射光强度预测,在单颗粒水平上证实了实验散射光强度与理论散射光强度的线性关系,我们发展了一种生物纳米颗粒折射率测定的新方法,实现了对T7病毒与细胞外囊泡等生物纳米颗粒的折射率测定。此外,通过构建外膜-内腔的折射率模型,在外膜折射率已知的条件下,实现了生物纳米颗粒内腔溶液折射率的测定,检测结果与文献报道的结果高度一致。基于蛋白、核酸溶液浓度与折射率的线性关系,在无标记、无需破坏生物颗粒结构的前提下,实现了生物纳米颗粒内腔组分浓度的精确定量。第四章为荧光偏振的单颗粒水平研究。发展了荧光二氧化硅纳米微球合成的新方法,制备了一系列荧光强度不同的荧光硅球。基于HSFCM对于纳米微球荧光检测的高灵敏度以及激光偏振方向的连续可控性,我们在单颗粒水平考察了激光偏振方向对于颗粒荧光强度的影响,系统地研究了颗粒的荧光强度随入射光偏振角的变化趋势。结合荧光分光光度计的荧光定量分析与HSFCM的颗粒浓度准确测定,通过控制入射光偏振角度规避荧光偏振对荧光定量分析的影响,我们实现了单个二氧化硅纳米微球荧光当量的准确定量。第五章为总结与展望。对本论文中各部分研究工作进行总结,并在二氧化硅纳米微球合成与Mie散射理论计算的基础上,对后续的研究工作进行延伸与展望。