青藏高原是世界上海拔最高的高原,其平均海拔在4 000米以上,高寒、缺氧、降水少、日照长、辐射强,独特的自然地理环境使其富含特殊的微生物资源。但是由于全球气候的变化导致青藏高原气温不断升高,加之人类过度放牧的影响使得高寒草甸逐年退化,微生物生态系统被严重破坏。此外,由于能够利用培养技术获得的微生物种类不足自然环境中存在的1%,目前对该类型土壤的微生物多样性和资源调查存在很大的不足,阻碍了这些特殊微生物资源的开发应用。提取环境微生物宏基因组DNA及构建文库是研究未培养微生物的重要方法。因此,本研究利用宏基因组学技术首次对西藏米拉山高寒草甸土壤的微生物群落结构、功能微生物及微生物基因资源多样性进行了系统的研究,主要结果与结论如下:(1)针对高寒草甸土壤中腐植酸和有机质含量高、DNA提取非常困难的特点,首次选择和优化了适合该类型土壤样品不同分子量DNA提取及纯化的技术路线。通过对比不同DNA提取和纯化方法的研究表明:直接法提取的DNA片段小、杂质含量高,但是由于其提取效率高,结合操作简便的柱纯化方法,适合于微生物多样性研究;结合低速离心和Nycodenz密度梯度离心先分离出微生物细胞的间接法虽然DNA产率降低,但是纯度高、片段长,结合电泳纯化法更适合于构建大插入片段文库。(2)分别以pUC19质粒载体和pCC2FOS?载体构建了西藏米拉山高寒草甸土壤微生物宏基因组文库,为进一步开发利用其微生物资源奠定了基础。其中两个pUC19质粒文库(ZMp-1和ZMp-2)的平均插入片段长度分别为1 kb和4 kb;Fosmid文库(ZMf-vsmfba)包含30 624个克隆,平均插入片段为35 kb左右,库容量超过1 Gb;部分文库克隆末端测序结果表明,尽管构建两种文库的DNA提取和纯化方法不同,但是文库插入片段序列多样性丰富,都含有大量的未知微生物物种。(3)在直接提取宏基因组DNA的基础上,采用16S rRNA基因克隆文库技术研究表明:西藏米拉山高寒草甸土壤中细菌和古菌多样性具有一定特殊性;但是由于受到气候变化和人类活动的影响,退化草甸土壤的微生物群落结构发生了改变。古菌文库中与GenBank中序列相似性很低的未分类古菌类型占有很大比例,但是古菌类型非常单一,仅发现了嗜泉古菌界(Crenarchaeota)的未分类热变形菌纲门(Unclassified_Thermoprotei),其余为未分类古菌(Unclassified_Archaea),没有发现广域古菌界(Euryarchaeota)克隆;相比之下细菌类型丰富,基本涵盖了大部分土壤细菌基本类群。(4)由于草甸的退化使储藏在土壤中的大量碳氮加速释放将造成严重的环境问题,本研究进一步以氨单加氧酶(ammonia monooxygenase, amoA)基因为分子标记比较了不同退化程度草甸土壤样品中的氨氧化微生物(ammonia-oxidizing microorganisms, AOM)多样性发现:氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)在伴随草甸退化的硝化作用增强过程中的作用高于氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB),并且退化草甸土壤的硝化作用模式类似于温室保护地土壤。(5)根据已报道许多微生物能够分泌胞外蛋白酶降解线虫体壁及卵鞘的原理,新型蛋白酶的开发和利用在植物病原线虫的生物防治中具有重要作用。本研究在西藏高寒草甸土壤微生物的宏基因组DNA和文库的基础上,以蛋白酶为靶标对其微生物基因资源进行了调查,结果根据同源克隆方法得到了75条新丝氨酸蛋白酶基因片段;通过pUC19质粒文库克隆末端测序分析得到了7条新的类蛋白酶基因片段;利用Fosmid文库的大插入片段表达特性筛选到了2个新蛋白酶基因序列,表明西藏高寒草甸中蕴含着丰富的可利用新基因资源,具有极高开发利用价值。综合以上结果,本研究表明西藏高寒草甸土壤微生物群落的组成具有特殊性,其中有大量的未知微生物及其基因信息有待挖掘和开发利用。但是由受到环境和人为活动的影响,高寒草甸的退化导致微生物群落为适应环境压力而通过改变其活性、生物量和结构来进行调整。无论是从资源角度还是环境角度来看,对西藏高寒草甸的保护及恢复都至关重要。