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背景结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC),是一种结直肠的粘膜上皮及腺体发生的恶性肿瘤。结直肠癌是世界第三大常见的恶性肿瘤,是最常见的高发性消化道肿瘤。结直肠癌的发病率居高不下,并且逐年提升,由于人们的生活条件、方式及饮食习惯随着经济和社会发展的变化而改变,而且结直肠癌的早期病变在人体症状上不明显,其死亡率在恶性肿瘤中稳居前三。结直肠癌的转移的进展是结直肠癌不良预后的重要原因,因此,明确结直肠癌进展的相关因素刻不容缓。RAB8A(Ras-related protein Rab-8A)是一个位于19号染色体短臂(19p13.11)上的蛋白编码基因,为RAS原癌基因蛋白家族成员。近年研究发现其可能为一个有效的肿瘤标志物,有文献报道RAB8A在子宫内膜癌中高表达。RAB8A在结直肠癌发生、发展中的具体生物学功能及其相关分子机制目前尚不清楚。目的检测RAB8A在结直肠的癌组织和正常组织以及不同结直肠癌细胞株的表达情况,构建过表达和干扰RAB8A基因的结直肠癌细胞株,并通过体外功能实验来分析RAB8A对结直肠癌细胞的增殖、迁移能力的影响,以明确该基因在结直肠癌进展中有何种作用。方法1.采用免疫组织化学染色法(immunohistochemistry,IHC)检测RAB8A在不同结直肠癌患者的癌组织及癌旁正常组织中的表达情况,并分析癌与正常组织的表达差异,以及RAB8A的表达水平与肿瘤患者的年龄、性别、肿瘤分化程度、有无淋巴结转移等相关临床病例参数之间的关系。2.利用蛋白印记法(Western blotting,WB)和实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)实验检测RAB8A的蛋白和mRNA在正常结直肠细胞株(NCM460)以及不同癌细胞株(SW480、SW620、DLD-1、HCT-116、RKO、LOVO)中的表达情况。3.用瞬时转染的方法构建RAB8A干扰及过表达细胞株,并通过qPCR和WB方法来检测所构建细胞株中RAB8A的mRNA和蛋白的表达。4.采用细胞增殖毒性检测(Cell Counting Kit-8,CCK-8)以及平板克隆实验观察RAB8A对不同肠癌细胞的增殖能力的影响;采用Transwell以及细胞划痕实验观察RAB8A对不同结直肠癌细胞的迁移能力的影响。5.用Western blotting来检测在RAB8A过表达以及干扰的细胞株中EMT的相关蛋白的表达情况。结果1.RAB8A在结直肠癌患者石蜡标本中的表达情况:免疫组织化学染色显示RAB8A的表达主要定位于细胞浆,经统计结直肠癌和正常组织间的表达具有差异(P<0.05)。2.RAB8A在正常结直肠细胞及癌细胞株中的表达情况:qRT-PCR和Western blotting的实验结果表明RAB8A在DLD-1、SW620、HCT-116细胞株中的mRNA和蛋白表达量高于SW480、RKO、LOVO以及NCM460细胞株(P<0.05)。3.选取两种RAB8A较低表达细胞株,即RKO和SW480,构建RAB8A过表达细胞株,分别命名为RKO-Vector、RKO-RAB8A,SW480-Vector、SW480-RAB8A;选取两种RAB8A较高表达细胞株,即SW620和HCT-116,构建RAB8A干扰细胞株,分别命名为SW620-Control、SW620-shRAB8A,HCT-116-Control、HCT-116-shRAB8A,同时采用qRT-PCR和WB方法步验证所构建细胞系RAB8A的表达均有显著差异(P<0.05)。4.CCK-8实验结果:RAB8A过表达细胞株生长速度显著快于对照组(P<0.05);RAB8A干扰时细胞株生长速度显著慢于对照组(P<0.05)。5.平板克隆实验结果:RAB8A过表达细胞株的单克隆形成数量明显多于其所对应的对照组(P<0.05);RAB8A干扰的细胞株的单克隆形成数明显少于其所对应的对照组(P<0.05)。6.Transwell实验结果:RAB8A过表达细胞株的细胞穿膜量明显多于其所对应的对照组(P<0.05);RAB8A干扰的细胞株的细胞穿膜量明显少于其所对应的对照组(P<0.05)。7.细胞划痕愈合实验结果:RAB8A过表达细胞株的划痕愈合速度明显快于其所对应的对照组;RAB8A干扰的细胞株的划痕愈合速度明显慢于其所对应的对照组。8.EMT相关蛋白表达:RAB8A过表达时Vimentin表达显著高于Vector组,E-Cadherin表达显著低于Vector组;RAB8A干扰时Vimentin表达显著低于Control组,E-Cadherin表达显著高于Control组。结论1.RAB8A在结直肠癌组织中表达明显上调,其表达水平与癌的分化呈负相关。2.RAB8A对结直肠癌细胞的增殖和迁移有促进作用。3.RAB8A对影响EMT相关蛋白的表达,促进EMT。