第一部分睾丸显微取精术后用第二代高通量测序技术对非梗阻性无精子症患者中找到和未找到精子组间睾丸组织内的piRNA进行测序分析【目的】piRNA是一类长度约为30个核苷酸的小非编码RNA,其主要特异性与piwi亚家族蛋白相互结合形成piRNA沉默复合体(piRNA-induced silencing complex,pi RISC)来调控基因沉默的过程,并在哺乳动物生殖细胞中特异性表达。虽然piRNA在精子发生的调节中发挥重要作用,例如泛素化降解和抑制转座子调节相应m RNA的表达和靶基因甲基化修饰等方式,但在男性不育的睾丸组织中,我们对于它的认识却很少。因此在此次研究中,为了探究睾丸组织来源的piRNA表达谱能否作为临床上诊断男性不育症的分子标志物,我们系统地检测了在通过睾丸显微取精术(micro-TESE)后,非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)患者找到精子组和未找到精子组间的睾丸组织来源的piRNA表达谱,分析表达显著差异的piRNA,作为预判NOA患者睾丸组织内是否还有残存生精位点的生物学标志物,可减轻病人心理上和经济上的负担,以及身体上不必要的伤害。【方法】收集通过睾丸显微取精术后NOA患者找到精子组和未找到精子组废弃的睾丸组织样本,分别提取各组样本的总RNA,质检合格后进行small-RNA建库,并使用Illumina X10测序平台进行测序分析,最后对测序结果中表达显著差异的piRNA进行q RT-PCR验证。【结果】通过对睾丸组织高通量测序总共测到18324个piRNAs,其中有959个piRNAs在找到精子组和未找到精子组间的表达是显著变化的,而这里面又有951个piRNAs在未找到精子组中是显著下调的,8个是显著上调的。此外,有553个睾丸特异性表达的piRNAs仅存在于找到精子组中,在未找到精子组中并未发现表达,这提示这553个piRNAs可作为预判睾丸显微取精术是否能找到精子的分子标志物。最后,总共挑取了20个表达显著变化的piRNAs,通过q RT-PCR的方法来验证其测序的结果。并且生物信息学分析揭示了这些表达变化的piRNAs涉及到许多重要的生物学过程相关的通路,其中包括凋亡,细胞增殖以及分化等。【结论】我们的实验结果证实了piRNA在成功取到精子和未取到精子的NOA患者睾丸组织中展现出了不同的表达谱。本研究为进一步阐明piRNA在男性精子发生中的调控作用提供了有利的证据,并为确定在辅助生殖治疗中预测NOA患者睾丸组织中残存生精位点的有效生物标志物提供了重要依据。第二部分在正常人和非梗阻性无精子症(NOA)患者的精浆中检测找到和未找到精子组来源的睾丸组织差异表达piRNA的表达情况【目的】发现在NOA患者中找到精子组相对于未找到精子组表达水平显著改变的piRNA,并把这些piRNA作为NOA患者micro-TESE术前预判是否能够成功取到精子的生物靶标,这样有利于提高micro-TESE的成功率并且减少患者因手术带来的身心伤害。【方法】按照foldchange>2倍,reads数>300的筛选标准,在高通量测序的结果中找到表达量具有显著差异的piRNA,并从中筛选出20个piRNA,用q RT-PCR方法在NOA患者USRG与SSRG中进行验证,然后再将从文献中报道的来源于成年男性正常睾丸组织的piRNA与这20个piRNA进行对比,并从中挑选出4个piRNA(hsa-pi R-6254、hsa-pi R-5026、hsa-pi R-11482和hsa-pi R-17765),利用q RT-PCR方法检测在NOA患者与正常成年男性精浆中这四个piRNA的表达量。【结果】发现这4个piRNA(hsa-pi R-6254、hsa-pi R-5026、hsa-pi R-11482和hsa-pi R-17765)是来源于正常成年男性附睾或睾丸的精浆中,并且,在正常成年男性和NOA患者的精浆中,hsa-pi R-6254和hsa-pi R-17765的表达量具有显著差异(P<0.05)。【结论】这4个精浆来源的piRNA(hsa-pi R-6254、hsa-pi R-5026、hsa-pi R-11482和hsa-pi R-17765)单个或者组合有望作为NOA患者睾丸显微取精术前预判是否能够成功取到精子的生物学分子标志物。