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石斛兰(Dendrobium)是一种具有较高观赏价值的热带兰花。本研究以春石斛和铁皮石斛原球茎为材料,进行石斛兰离体再生体系优化、试管开花研究,花器官发育相关基因LRR-RLK基因克隆及其在试管开花过程中的定量表达研究。主要结果如下:1.石斛兰离体再生体系的优化以保存5年的春石斛原球茎为材料,采用L9(34)正交试验设计,比较不同NH4+-N: NO3--N比值、6-BA浓度以及香蕉匀浆物浓度对原球茎增殖的影响,结果表明:KC+6-BA 1.0 mg/L+香蕉匀浆物10 g/L最适宜春石斛原球茎的增殖,其中香蕉匀浆物对其影响最大,最适宜的浓度为10 g/L;以保存5年的春石斛和铁皮石斛原球茎为材料,采用L9(34)正交试验设计,比较不同浓度的6-BA、白糖和香蕉(或椰汁)对其壮苗生根条件的优化,结果表明:香蕉添加物比椰汁更能促进春石斛试管苗的壮苗生根,适宜春石斛壮苗生根的培养基为1/2MS+6-BA0 mg/L+白糖20 g/L+香蕉50 g/L,而对于铁皮石斛,椰汁更有利于其壮苗生根,最佳培养基为1/2MS+6-BA0 mg/L+白糖30 g/L+椰汁100 mL/L更适宜铁皮石斛试管苗的壮苗生根。2.石斛兰试管开花研究从不同培养基、不同浓度6-BA、改良培养基、不同浓度ZT、TDZ、不同浓度马铃薯添加物等单因子以及这些因子结合使用对春石斛试管苗开花的条件进行了研究。结果表明:多因子比单因子更容易促进春石斛试管苗的开花,而且多因子结合使用更容易获得正常的试管花,改MS(1/10 N,NH4+-N:NO3--N为4:1)+TDZ0.1 mg/L+白糖20 g/L+CW100 mL/L+ PP3331.0 mg/L,14℃低温处理20 d为春石斛试管苗花芽诱导率最高的处理,诱导率达到31.91%,NH4+-N:NO3--N、N、TDZ、PP333、糖、椰汁、低温和PP333对花芽诱导率的影响均达到显著水平,而改MS(1/10 N,NH4+-N:NO3--N为2:1,5 P)+TDZ0.2 mg/L+白糖40 g/L+CW100 mL/L+ PP3331.0 mg/L,14℃低温处理30 d为春石斛正常试管花的诱导培养基,各因素对其影响程度依次为:糖>PP333>低温>P>TDZ=椰汁>NH4+-N:NO3--N>N。从不同浓度的6-BA和TDZ对铁皮石斛试管苗花芽诱导的影响进行了研究。结果表明:TDZ比6-BA更适宜铁皮石斛试管苗花芽的诱导,最适培养基为1/2MS+TDZ0.2 mg/L+CW100 mL/L+白糖20 mg/L,花芽诱导率最高达到94.79%(以花芽统计)和62.50%(以开花的试管苗统计)。3.春石斛原球茎LRR-RLK基因的克隆以春石斛原球茎为材料,提取总RNA,进行春石斛LRR-RLK基因克隆研究。试验结果表明:使用通用植物总RNA提取试剂盒提取的RNA条带清晰、明亮,但有DNA污染;改进的Trizol试剂法提取的结果虽不稳定,易降解,但无DNA污染,纯度较高,在不同的试验阶段应根据试验要求选择不同的方法提取石斛兰总RNA。根据已有其它植物LRR-RLK基因保守区序列设计一对引物,用RT-PCR扩增出特异片段,得到了春石斛保守区和3’端序列,整个片段长1034 bp,并得到一个由531个碱基组成的开放阅读框,编码176个氨基酸,通过核苷酸序列和氨基酸序列的Blast比对发现:春石斛LRR-RLK基因的核苷酸序列与已登录的其它植物LRR-RLK基因同源性较高,最高达到74% ;而其编码的氨基酸序列与多种物种均达到90%以上。已经在GenBank上登录,登录号为GU357498.1。4.春石斛试管苗开花过程中LRR-RLK基因表达的荧光定量PCR分析采用荧光定量PCR技术,对春石斛试管苗开花过程中LRR-RLK基因在mRNA水平上的表达进行了定量研究。试验首先克隆了内参基因EF-1α,得到了长716 bp的片段,编码237个氨基酸序列,通过核苷酸序列和氨基酸序列的Blast比对发现春石斛EF-1α基因的核苷酸序列与已登录的其它植物EF-1α基因同源性非常高,适宜作为荧光定量表达过程中的内参基因的待选基因。已经在GenBank上登录,登录号为GU382674.1。对2个待选内参基因EF-1α基因和18S rRNA基因进行了筛选比较,结果表明:18S rRNA更适宜作为春石斛LRR-RLK基因定量表达分析的内参基因。对春石斛离体开花过程中LRR-RLK基因的定量表达分析表明:在原球茎阶段,LRR-RLK基因表达量较高,在普通培养基中培养分化成幼苗后逐渐升高,当把幼苗转入花芽诱导培养基中之后,表达量逐渐降低,直到形成花芽时降到最低,当花芽转变到成花时,LRR-RLK基因表达量又上升,说明LRR-RLK基因可能在芽的分化以及春石斛花芽成熟过程中发挥重要的作用。