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研究目的:外泌体是由大多数细胞释放的30-150nm的囊泡。近年来巨噬细胞已成为肿瘤微环境的关键调控细胞。巨噬细胞产生的外泌体在免疫细胞与肿瘤细胞的通讯中起着重要作用。骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDMs)越来越多地用于体外研究肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)。但是,对于Balb/c小鼠骨髓来源的巨噬细胞,目前还没有统一的标准化外泌体分离方案。因此,本研究旨在探索一种可从BMDMs上清中获得更纯净、更高产量外泌体的优化方案。研究方法:我们评估了三种从细胞培养上清液中分离外泌体的方法,包括超速离心法、聚乙二醇(PEG)沉淀法和磁珠免疫亲和法。然后采用透射电镜(TEM)、纳米粒子跟踪分析(NTA)和免疫印迹法对分离的囊泡进行鉴定。研究结果:1.超速离心法、聚乙二醇(PEG)沉淀法和磁珠免疫亲和法三种方法在外泌体的分离中各有优缺点。2.TEM和NTA结果表明,超速离心法可以获得纯度较高的外泌体但产率较低。与超速离心法相比,PEG沉淀法和免疫亲和法有着相对较高的外泌体产量。然而,这两种方法分离的囊泡中携带有较多的杂蛋白。3.Western blot结果显示:PEG沉淀法和超速离心法分离的囊泡外泌体标志物(TSG101,Alix)均为阳性。4.超速离心4小时可以分离出最高产量的外泌体。该优化方案可成功用于分离肿瘤相关巨噬细胞来源的外泌体。结论:通过比较三种方法分离BMDMs外泌体的纯度和产量,我们发现超速离心是最佳的选择。经进一步优化,超速离心4h可以从BMDMs和TAMs培养上清液中分离得到高产量高纯度的外泌体。研究目的肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociatedmacrophages,TAMs)广泛存在于大多数恶性肿瘤中[32],具有促进肿瘤血管生成[33]、帮助肿瘤转移、抑制抗肿瘤免疫的功能[34]。乳腺癌是女性常见的癌症,也是全球女性癌症相关死亡的主要原因。其主要死因是发生肿瘤转移和肿瘤产生对全身化疗的抵抗。目前研究表明肿瘤的转移与肿瘤细胞具有的干性特征密切相关。外泌体是直径l00nm左右,可由多数细胞分泌的细胞外囊泡,其内可包含蛋白质、RNA、脂类等生物分子,并在细胞交流中发挥重要作用。在大多数人和鼠的肿瘤组织中,肿瘤相关巨噬细胞的表型和功能更倾向于M2型巨噬细胞[32]。近些年的研究发现TAMs来源的外泌体广泛参与了 TAMs促肿瘤的过程。已有报道表明,上皮性卵巢癌中TAMs可释放外泌体扰乱Treg/Th17细胞的平衡[35],在胃癌中TAMs来源的外泌体可增强胃癌细胞的化疗抵抗性[36]。本研究旨在通过在体外诱导M2型巨噬细胞模拟TAMs,探讨肿瘤相关巨噬细胞来源的外泌体对乳腺癌细胞系4T1细胞干性特征的影响,为肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤发展的机制提供新的思路。研究方法通过体外诱导巨噬细胞为M2型巨噬细胞来模拟肿瘤相关巨噬细胞。用超速离心法分离M2型巨噬细胞来源的外泌体,用透射电子显微镜、纳米粒子追踪技术,Western blot等对其进行鉴定。然后以4T1乳腺癌细胞系为肿瘤模型,使用Dil染料标记M2型巨噬细胞来源的外泌体,通过免疫荧光技术观察其能否进入4T1细胞。此外,用流式细胞术、共培养体系和Transwell实验探究在M2型巨噬细胞来源的外泌体影响下的4T1细胞的干性特征。研究结果1.应用IL-4/13成功在体外诱导BMDMs细胞成为具有M2表型巨噬细胞,利用TEM,NTA,western blot鉴定了 M2型巨噬细胞来源的外泌体的特征。2.通过免疫荧光观察到Dil标记的外泌体可成功进入4T1细胞质中。3.M2型巨噬细胞来源的外泌体与4T1细胞共孵育后,可明显增强4T1细胞的迁移能力和成球能力。4.外泌体抑制剂GW4869可明显抑制4T1细胞的成球能力。5.M2型巨噬细胞来源的外泌体可明显增加4T1细胞中CD44highCD24low细胞的比例。结论肿瘤相关巨噬细胞来源的外泌体能够促进4T1肿瘤细胞的迁移和成球能力,并明显增加4T1细胞中肿瘤干细胞的比例。