背景与目的：　　死亡时间(Postmortem Interval,PMI)指从机体死亡至尸检时的间隔时间。PMI的推断可大致分为早期、晚期和白骨化推断三个阶段,由于存在诸多难以避免的人为及外界环境等因素的影响,死亡时间难以准确推断。准确地推断PMI,对于杀人案件的刑事侦查,及其他案件均具有重要的证据价值,推断PMI至今仍是法医鉴定工作的重点和难点问题。随着医学科学技术的快速发展,推断PMI的手段从早期主要依靠尸体现象,发展到现在综合利用生物物理学、生物化学、免疫组织化学、分子生物学等技术手段。但迄今,尚无公认的准确可靠、简单易行的推断PMI方法。　　生物力学(biomechanics)是应用力学原理和方法进行生物组织力学方面定量研究的物理学分支,已在医学领域应用广泛,形成了专门的医学生物力学,其在法医学领域的应用主要集中在机械性损伤的力学机制研究。尚未见应用生物力学手段推断死亡时间的系统研究。　　本课题组前期基于尸体自溶腐败过程中,组织的生物化学降解必然导致其形态结构改变,而组织结构改变又必然导致其生物力学性状改变的本构关系或构效关系原理,先后以大鼠和家猪软组织为研究对象,初步证实了尸体组织器官生物力学性状随死亡时间延长的时序性变化和其推断PMI的可行性。　　本实验在课题组前期研究基础上,同步应用生物力学和生物化学的理论和技术,探讨了皮肤组织生物力学性状和固定-萃取液生物化学物质含量的时序性变化规律,及其与PMI的相关性。同时,观察皮肤组织大体形态、组织结构,应用计算机显微病理图像处理技术,量化分析皮肤组织形态结构与生物力学性状变化的构效关系,期望为法医学推断PMI提供新的理论依据和技术方法。　　材料与方法：　　1、实验动物5头4月龄阉割成年家猪(太湖猪种,汕头屠宰场),平均体重150kg,常规主动脉放血屠宰后,立即切取胸腹部平整区域的皮肤组织,放置25℃湿度70％±5%恒温恒湿人工气候箱保存。　　2、取材规范时间组:从气候箱保存时间算起,按0h、24h、48h、72h、96、120h、144h、168h、192、216、240h、264h分12个时间组,5头/组。　　遵循“六定”原则:　　①定时。按分组时间点取材,每头家猪每个时间点取4块组织试件。　　②定向定位。统一平行皮纹方向,切取5cm×1.5cm厚薄较均匀的矩形胸腹部皮肤组织样本。　　③定液定比。蒸馏水与甲醛原液9:1配制10%甲醛溶液固定液,试件质量与固定液体积比1:10固定组织试件,密闭避光固定72h后取出组织试件,进一步处理等待上机测试。　　④定形。上机测试前,用游标卡尺测量,将试件切成4cm×1cm标准试件,控制厚度3mm±0.5mm,福尔马林浸湿纱布保湿,上机检测。　　3、组织形态学观测　　⑴大体观察和记录各时间点的家猪皮肤组织的色泽、质地、形态、气味等变化情况。在自制固定光源照度箱内,采用数码相机1400万像素拍照皮肤表面照片,应用Photoshop CS5读取各样本照片RGB值。　　⑵参考生物力学性状参数选择差异显著的4个时间段内0h,48h,72h,144h,168h,192h,216h,264h等8个时间组,备制皮肤组织石蜡切片,常规HE染色和胶原-网状-弹力纤维三联染色,使用Leica Application Suite Version 4.0.0图像分析系统,观测各时间点的皮肤组织形态结构,并拍摄光镜显微组织照片,采用Image-Pro Plus 6.0病理图像量化分析软件,校准标尺空间后,特殊染色分析设定histogram basedRGB(R门槛值为103,G门槛值为193,B门槛值均为211),20倍视野下,计算胶原纤维总面积、弹性纤维总面积、平均胶原纤维直径,以及非胶原纤维总面积等指标。　　4、生物力学实验　　采用WDT-Ⅲ电子万能材料试验机,进行拉伸测试,室温下,20mm/min匀速单轴拉伸测试,测试前进行10次预调试,预调间隔约30s。主要检测记录极限载荷、极限载荷变性,断裂力、平均力等指标。同时,观察试件大体形态变化。生物力学实验完成后选取部分试件备制常规HE染色切片、胶原纤维染色,进行组织形态学观察,显微图像处理量化分析皮肤组织胶原、胶原纤维空隙面积等指标。　　5、生物化学检测　　⑴提取组织试件后,使用滤纸将组织固定-萃取液过滤到50mlEP管内,pH计检测pH值;　　⑵提取4.0ml上清液,5000转离心处理后用紫外-可见光分光光度仪进行色度检测;　　⑶提取上清液0.5ml,茚三酮染色后,用紫外-可见光分光光度仪检测其蛋白质及其降解物含量。　　6、实验数据统计处理　　采用excel、SPSS16.0统计软件对所得数据进行分析,各组数值以均数±标准差(`x±s)表示,采用独立样本t检验及单向方差分析(One-way ANONA),统计学检验的显著性水平定义为:P<0.05为差异有显著性。　　结果：　　1、形态学观察　　⑴肉眼大体观察。随PMI延长,各时间点皮肤组织颜色变化不明显,质地逐渐瘫软、液化;48h出现臭味,以后逐渐明显;96h开始可见皮表以毛孔为中心逐渐凹陷,随时间延长凹陷逐渐扩大,数目增多;216h组织自溶液化,部分组织全层溶解呈孔状。　　⑵组织形态学及其显微图像量化分析。随PMI延长,各时间点皮肤胶原纤维逐渐模糊、破碎、组织间隙扩大;非胶原纤维总面积呈逐渐增大趋势,各时间点方差分析S-N-K法多重比较0h~48h,72h~144h,168h~192h,216h,264h等时间段与时间点相互之间差异显著,P<0.05,推断PMI窗口期48h~264h,回归方程:YNCFSA=232269XPMI+406884,R2=0.920。胶原纤维总面积,弹性纤维总面积和平均胶原纤维直径个时间点无明显差异,P>0.05,与PMI无相关性。　　2、生物力学性状　　0h-264h,皮肤组织生物力学性状参数呈整体阶梯状下降趋势,与PMI相关性明显,极限载荷各时间组方差分析S-N-K法多重比较0h~48h,72h~144h,168h~192h,216h~264h等时间段之间差异显著,P<0.05,推断PMI窗口期48h~216h,与PMI回归方程:YML=-33.192XPMI+375.075R2=0.779;平均力方差分析S-N-K法多重比较0h~48h,72h~192h,216h~264h等时间段之间差异显著P<0.05,推断PMI窗口期48h~216h,与PMI的回归方程:YAL=-13.628XPMI+167.121R2=0.653,极限载荷变形,断裂力等各时间组相互比较P>0.05,PMI无相关性。　　3、组织固定-萃取液检测　　⑴皮肤组织固定-萃取液色度值5例家猪皮肤组织固定-萃取液色度值随PMI延长呈阶梯状上升趋势,各时间组方差分析S-N-K法多重比较0h~48h,72h~120h,144h~264h等时间段之间差异显著,P<0.05,推断PMI窗口期48h~144h,直线回归方程为:YChr=3.004XPMI-1.560R2=0.710。　　⑵茚三酮染色5例家猪皮肤组织固定-萃取液茚三酮染色后Abs570(±10)nm值随PMI延长呈阶梯状上升趋势,各时间组差分析S-N-K法多重比较0h~24h,48h~120h,144h~216,240～264h等时间段差异显著,推断PMI窗口期24h~240h,直线回归方程为:YAbs570(±10)nm=0.075XPMI-0.068R2=0.776。　　⑶pH值5例家猪皮肤组织固定-萃取液各时间组pH值无明显差异,P>0.05。　　结论：　　1、水中家猪皮肤组织极限载荷PMI延长呈时序性下降趋势,与PMI之间呈明显的相关性,推断PMI窗口期为48～216h,精确度达±24h,可作为一种推断晚期水尸PMI的技术手段。　　2、水中家猪皮肤组织固定-萃取液色度值和茚三酮反应后Abs570(±10)nm值随PMI延长呈上升趋势,其中色度值推断PMI窗口期为48～144h,Abs570(±10)nm值为24～240h,精确度达±12h。　　3、水中家猪皮肤组织非胶原纤维总面积随PMI延长呈上升趋势,反映了胶原纤维总面积随PMI延长逐渐减小,结合皮肤组织生物力学和固定-萃取液生物化学指标的实验结果,符合生物化学变化决定组织结构变化,组织结构变化决定生物力学变化的本构关系和构效关系的基本原理。