论文部分内容阅读
牛肠道病毒（Bovine enterovirus,BEV）感染是临床上以消化系统和呼吸系统病症为特征的传染病,给养牛业造成了较为严重的经济损失。目前,国内许多地区报道有该病的暴发。由于本病在国内为新发传染病,有关该病的发病机理及病毒与宿主细胞间的互作等方面缺乏研究。本研究应用酵母双杂交技术,以肠道病毒HY12毒株的结构蛋白VP1构建重组质粒,表达诱饵蛋白,通过筛选及鉴定与VP1互作的宿主蛋白,探究病毒与宿主蛋白之间的相互作用,以期确定VP1蛋白在病毒入侵机体过程中的功能,为最终阐明肠道病毒感染机制奠定基础。为筛选E种肠道病毒HY12毒株编码的VP1蛋白的宿主互作蛋白,本实验应用PCR技术扩增出HY12病毒VP1蛋白基因的完整序列,并将其克隆到酵母载体pGBKT7中,构建重组诱饵质粒pGBKT7-VP1。将重组质粒转化到酵母菌株AH109中,通过对比重组质粒组和空白质粒组不同时间点的OD600值,检测其对酵母细胞的毒性,并把含有诱饵重组质粒的酵母菌涂布在缺陷型培养基上验证其自激活活性。将转有诱饵载体的AH109菌株与表达酵母双杂交MDBK细胞cDNA文库的Y187菌株混合培养,通过缺陷型培养基筛选杂交成功的菌落,并应用序列测定与比对分析等方法进行验证。提取阳性菌落的酵母质粒,通过PCR和α-半乳糖苷酶实验,筛选到12个潜在VP1蛋白的互作蛋白。将构建好的pbJun-VP1和pbFOS-候选蛋白共转入293T细胞中,通过双分子荧光互补技术,在荧光显微镜下观察二者是否互作。同时,构建真核重组质粒pcDNA3.1B-VP1和pCMV-Tag 2B-候选蛋白,利用免疫共沉淀技术验证相互作用关系。综上所述,本研究通过PCR等技术成功构建出酵母双杂交体系所需的诱饵载体pGBKT7-VP1,通过缺陷型培养基以及对OD600值的测定验证无自激活活性和细胞毒性。文库菌液的滴度为108 cfu/mL,随机挑取的44个克隆的插入片段大小范围为200 bp～2 000 bp,说明文库多态性良好,丰度较高。将转有诱饵载体的AH109菌株与含有酵母双杂交MDBK细胞cDNA文库的Y187菌株混合培养,通过缺陷型培养基及PCR等方法共筛选到12个阳性克隆,即潜在互作蛋白,经序列测定与比对分析后,挑选其中两个蛋白PAK1和ACTG1,经α-半乳糖苷酶实验初步验证VP1与PAK1及ACTG1之间可能存在相互作用关系。构建真核重组质粒,经Western Blot验证,VP1、PAK1和ACTG1均可在细胞中表达。利用免疫共沉淀实验和双分子荧光互补实验进一步验证其与VP1蛋白的互作关系,为BEV感染机制及病毒结构蛋白VP1功能的研究奠定基础。