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第一部分人外周血CD34+细胞的体外原代培养鉴定及生物学特性目的：通过梯度密度离心法和免疫磁珠分离法从人体外周血中获取CD34+细胞,在体外原代培养、扩增、鉴定、冻存与复苏,探讨其生物学特性,为患者再次干细胞移植提供可能的干细胞来源。方法：使用梯度密度离心法采集人外周血中单个核细胞,应用免疫磁珠吸附法获取CD34+细胞,在含有生长因子的X-VIVO培养液和高糖DMEM培养液中继续培养扩增。光镜观察细胞形态、生长特性；全自动活细胞观测分析系统(Cell-IQ)动态观察细胞分裂及迁移；免疫荧光技术对其表面标志物CD34及CD133进行鉴定；冻存CD34+细胞1年后复苏观察细胞活性。结果：原代培养的CD34+细胞在X-VIVO培养液中呈悬浮生长,3d细胞集落形成,5d有少量细胞开始贴壁生长,7d纺锤形的细胞数量增多,9d开始出现细胞碎片,此时悬浮细胞与贴壁细胞分开培养,贴壁细胞用高糖DMEM培养,悬浮细胞继续用X-VIVO培养,14d悬浮细胞大部分死亡,贴壁细胞集落形成。Cell-IQ动态观察细胞平均的分裂时间为90分钟,几乎所有的悬浮细胞均向中央移动。免疫荧光鉴定细胞表面标志物CD34(+)和CD133(+)。-80℃冰箱直接冻存,1年后复苏,应用Cryostor冻存液,细胞活力为(89.0+2.58)%,应用DMSO冻存液细胞活力为(84.9±3.28)%,两者有统计学意义。结论：纯化的CD34+细胞在体外培养扩增是可行的,冻存复苏后对细胞的活力影响较小,为患者再次移植提供足够的干细胞来源成为可能。第二部分CD34+细胞移植治疗裸鼠后肢缺血的实验研究目的：观察人外周血CD34+细胞移植治疗裸鼠后肢动脉缺血的效果,并且探讨其可能的机制。方法：裸鼠36只,随机分为CD34组、X-VIVO组和假手术组,每组12只,CD34组、X-VIVO组剥离左侧股动脉至胭动脉水平,制备成裸鼠后肢动脉缺血模型,观察其后肢缺血情况,假手术组不剥离血管,其余同前两组。饲养1周后CD34组裸鼠给予含有CD34+细胞(1×105cells)的X-VIVO培养液0.1ml注射于患肢缺血肌肉组织中,X-VIVO组裸鼠注射不含CD34+细胞的X-VIVO培养液0.1ml,假手术组仅注射生理盐水0.1m1,饲养2周后取裸鼠内收肌和半膜肌标本,抗CD31和抗CD34免疫组织化学染色,显示血管内皮细胞、血管密度；Real Time-PCR检测组织中VEGF和bFGF mRNA的表达情况；结果：免疫组化染色显示CD34组微血管密度较X-VIVO组和假手术组明显增加。RT-PCR检查显示CD34组VEGF和bFGF mRNA表达最强,其次是X-VIVO组(P<0.05),假手术组则最低(P<0.05)。结论：应用CD34+细胞移植可以明显促进血管新生、侧枝血管形成进而增加下肢缺血组织的血流灌注。第三部分纯化自体外周血CD34+细胞移植治疗肢体重度缺血的临床研究目的：研究临床应用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员后经外周血采集单个核细胞(PB-MNC),免疫磁珠分选仪提取纯化CD34+细胞移植治疗肢体重度缺血的安全性,可行性和有效性。方法：自2009年5月至2011年7月,入组患者共25例,其中治疗下肢25条和上肢3条,平均年龄44±12岁,均不具备外科血管重建条件。G-CSF(5-10μg/kg)动员第5天采集外周血单个核细胞,分选获得纯化CD34+细胞,肢体肌肉局部注射,所有病例分为3组：低剂量组(105/kg)、中剂量组(5×105/kg)和高剂量组(106/kg)。观察不良反应和缺血缓解情况。结果：随访6-33个月,1个月和2个月时Wong-Baker FACES疼痛评分由术前7±2分别下降到3±3(P=0.0000)和1±2(P=0.0000)；3个月和6个月时,平板试验无疼痛步行时间从术前4±3min上升到13±7min(P=0.0005)和18±6min(P=0.0000)；踝肱指数从术前0.46±0.21上升到0.60±0.17(P=0.003)和0.67±0.15(P=0.001)；经皮氧分压由27±10mmHg升至41±11mmHg(P=0.0001)和55±12mmHg(P=0.0000);14例溃疡患者愈合10例,4例在3个月内行截肢术；Kaplan Meier生存分析法计算6个月保肢率为84%(95%可信区间为0.63～0.94)。比较3组(低剂量组5例;中剂量组11例;高剂量组9例),1个月时Wong-Baker FACES疼痛评分高剂量组(6.3±1.7)较低剂量(3.2±3.3,P=0.0487)和中等剂量组(3.7±2.8,P=0.0352)明显改善,其余没有发现显著差异。结论：经G-CSF动员采集PB-MNC提取纯化CD34+细胞移植治疗肢体重度缺血性疾病是可行、安全和有效的。