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牛樟芝(Antrodiacamphorata)为非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌属真菌,别名有:牛樟菇,樟菇,红樟芝,樟芝,血灵芝等。野生牛樟芝来源我国台湾省,是20世纪90年代新发现的真菌[1～4]。如今,国内牛樟芝培养品种繁多,主要有:椴木培养牛樟芝、固体发酵培养牛樟芝、皿式培养牛樟芝等。目的1.建立野生牛樟芝的UPLC指纹图谱,结合相似度评价体系和聚类分析方法,为野生牛樟芝质量控制体系,在稳定性、特异性方面进行定性研究;2.建立高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱(LCMS-IT-TOF)的液质联用对野生牛樟芝全成分的定性鉴别,解决和减轻因传统化学成分提取、纯化、鉴定分析方法带来的不便利与高昂的科研成本,为牛樟芝物质基础研究提供科学依据及研究思路。3.利用离子阱-飞行时间质谱(IT-TOF MS)质谱仪定性鉴定比较四种不同培养品种的牛樟芝(野生牛樟芝、椴木培养牛樟芝、固体发酵培养牛樟芝、皿式培养牛樟芝),从化学成分的角度,进行准确、快速的区分,解决市场上牛樟芝的鱼目混珠,以次充好的社会问题。4.建立牛樟芝UPLC-DAD的含量测定方法,为牛樟芝质量控制提供科学依据。方法1.野生牛樟芝的UPLC指纹图谱及聚类分析通过对液相洗脱梯度、流动相、最大吸收波长、流速、色谱柱、柱温六个方面进行优选,在确立色谱条件的基础上,对野生牛樟芝提取方法、提取溶媒、料液比、提取时间、提取次数进行系统的单因素考察,优化提取方案。再运用《中国药典》指定的2004版指纹图谱软件,进行野生牛樟芝指纹图谱相似度评价,并结合聚类分析方法,建立野生牛樟芝子实体UPLC指纹图谱。2.LCMS-IT-TOF野生牛樟芝的成分定性分析采用LCMS-IT-TOF液质联用质谱仪,通过UPLC超高效液相色谱仪,进行液相色谱分离,再利用离子阱-飞行时间质谱(IT-TOFMS)质谱仪,进行野生牛樟芝化学成分液质联用的定性鉴别,以Antcin A、antcin C、antcin H和antcin K四种樟菇酸类成分对照品进行验证,建立基于IT-TOF MS野生牛樟芝的化学成分的定性鉴别。3.IT-TOF MS比较四种牛樟芝培养品种的成分基于LCMS-IT-TOF液质联用质谱仪,通过UPLC-DAD获得紫外光谱,再结合IT-TOF MS质谱仪,ESI源作为离子源,雾化气流速为1.50 L/min,CDL温度为200℃C,加热板块温度为200℃C,检测器电压为1.56 kV,碰撞能量为50%,采集范围(m/Z)在100～1000,累积时间为50 ms,采集时间为65 min。在正离子模式下检测分析,获得高精度质谱数据,实现对四种牛樟芝培养品种化学成分质谱的定性鉴别,辅以Antcin A、antcin C、antcin H和antcin KK四种樟菇酸类成分对照品进行验证,建立基于IT-TOF MS四种牛樟芝培养品种化学成分的定性鉴别,并比较牛樟芝特有樟菇酸类成分在种类上的多寡。4.UPLC-DAD法测定牛樟芝四种樟菇酸类成分的含量四种牛樟芝培养品种,80%乙醇超声提取,采用Shim-pack GISS-C18(2.1×100 mm,1.9 μm)色谱柱,以0.1%甲酸-乙腈溶液为流动相梯度洗脱,检测波长为254 nm,流速0.20mL/min,柱温25℃,进样量1.O μμL采用UPLC超高效液相色谱仪,在优化色谱条件和提取方案的基础上,建立UPLC-DAD法对四种牛樟芝培养品种,四种樟菇酸类成分的含量测定。结果1.建立了 10批野生牛樟芝UPLC指纹图谱,标定了 17个共有峰,指认了 4个樟菇酸特征峰,分别为:AnticnK(1号峰)、anticnC(13号峰)、anticnH(15号峰)、和anticn A(21号峰),10批野生牛樟芝相似度在0.927～0.974,聚类分析,分类距离为10时,可细分为四类。同时,实验优化了野生牛樟芝的液相色谱条件和提取方案。2.建立了野生牛樟芝的LCMS-IT-TOF液质联用质谱仪全成分的定性鉴别分析方案,定性识别成分39个,鉴别出12个,分别为:Anticn K(2号峰),anticnN(3号峰),anticn D(9 号峰),lanosta-8,24-dien-3β,15α,21-triol(10 号峰),antroquinonol B(18 号峰),anticn C(22 号峰),anticn H(24 号峰),dehydrosulphurenic acid(30号峰),antrocinnamomins B(34 号峰),a-TocospiroB(35 号峰),anticnA(37 号峰),dehydroeburicoic acid(38 号峰)。3.建立了基于IT-TOF MS质谱仪,四种不同培养品种的牛樟芝(野生牛樟芝、椴木培养牛樟芝、固体发酵培养牛樟芝、皿式培养牛樟芝),在化学成分的定性鉴定比较方法。定性识别成分63个,鉴别出16个成分,分别为:Methyl antcinate B、dexamethasone、antrocinnamomin G、antcin K、antcin N、antcin D、lanosta-8,24-dien-3β,15α,21-triol、antroquinonol B、antcin C、antcin H、dehydrosulphurenic acid、methyl-3,11-dioxo-4α-methylergost-8,24(28)-dien-26-oate、antrocinnamomins B、α-Tocospiro B、antcin A、dehydroeburicoic acid。4.建立了牛樟芝的UPLC-DAD法的含量测定,在60 min内定量分析19批牛樟芝中4种樟菇酸类成分。在考察的浓度范围内呈良好的线性关系(r>0.999 7);日内精密度RSD为0.54%～1.39%,日间精密度RSD为0.39%～0.60%;稳定性试验48 h内RSD为1.22%～1.47%;重复性RSD为0.71%～1.86%;平均回收率和RSD分别在98.16%～104.78%和1.44%～2.44%。野生牛樟芝中4种樟菇酸类成分的平均含量分别为 Anticn K(1.15 mg/g),anticn C(8.58 mg/g),anticn H(8.58 mg/g),anticn A(1.36 mg/g)。结论1.所建立的10批野生牛樟芝UPLC指纹图谱,方法准确、专属性强、重复性好,可以快速、准确地鉴别和综合评价野生牛樟芝的质量,为野生牛樟芝的质量控制提供科学依据。2.所建立的LCMS-IT-TOF液质联用技术的定性分析,为野生牛樟芝的质量评价提供了可行的方法,突破了传统中药材需要提取、纯化、质谱、核磁等一系列繁杂流程,优化了中药化学成分定性鉴别研究的固有方案。3.所建立的IT-TOF MS质谱仪的定性分析方法,准确、方便,能鉴别分析牛樟芝不同培养品种的成分,能很好地解决市场上牛樟芝质量的良莠不齐、真假难辨的社会问题。4.所建立的测定牛樟芝中4种樟菇酸类成分的UPLC-DAD定量分析,方法简便、快捷、准确,为牛樟芝质量控制提供科学依据。