随着辅助生殖技术的广泛开展,卵母细胞的冷冻保存技术越来越受到关注,玻璃化冷冻成为卵母细胞冷冻保存的主要技术之一。而经过冷冻复苏后如何获得更高的移植率和临床受精率成为许多生殖中心关注的焦点。玻璃化冷冻的损伤尤其是对超微结构的冷冻损伤成为各实验室研究的重点,它也成为卵母细胞冷冻成败的关键。近年来,许多科研中心相继研究了玻璃化冷冻对动物卵母细胞超微结构的冷冻损伤如微管、纺锤体结构和发育潜能、皮质颗粒、线粒体、胞内膜电位等。而关于人类卵母细胞超微结构的实验研究相对缺乏。鉴于此,本研究主要讨论了玻璃化冷冻对体外成熟卵母细胞超微结构—微丝的影响,对比分析了冷冻前后卵母细胞微丝分布的变化；同时按照冷冻后不同的复苏时间对各组卵母细胞微丝形态的恢复情况进行了比较分析,选出最佳的复苏时间并在最佳时间内对玻璃化冷冻前后的卵母细胞行胞浆内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection, ICSI),进一步分析了玻璃化冷冻对人体外成熟卵母细胞发育潜能的影响。第一部分玻璃化冷冻对人体外成熟卵母细胞微丝分布的影响[目的]通过对体外成熟卵母细胞玻璃化冷冻后不同复苏时间和新鲜卵母细胞的染色分析,发现冷冻对微丝分布的影响及复苏的最佳时间。[方法]收集未成熟卵母细胞(GV/MI),经过体外培养为成熟卵母细胞,随机分为新鲜组和玻璃化冷冻组,玻璃化冷冻组按不同的复苏时间再次随机分为复苏后1h,2h,3h,4h组。所有卵母细胞用罗丹明标记的鬼笔环肽行微丝染色,之后用激光共聚焦显微镜(LSM780)观察。[结果]经过冷冻复苏后卵母细胞成活率为87.37%。新鲜组卵母细胞微丝分布的正常率为71.11%,复苏1h、2h、3h、4h后卵母细胞微丝分布正常率分别为34.15%、44.18%、69.05%、65.79%。与新鲜组相比,复苏后1h、2h均具有显著性差异(P<0.01,P=0.02),复苏后3h、4h均无显著性差异(P=1.00,P=0.64),1h、2h之间与3h、4h之间相比均无显著性差异(P=0.35,P=0.81)。[结论]玻璃化冷冻复苏过程改变了人体外成熟卵母细胞的微丝分布,但是经过恰当的复苏时间后微丝分布可恢复至新鲜状态,继续增加复苏时间并不会增加卵母细胞微丝分布的正常率。说明合适的冷冻复苏(约3h以上)并未改变体外成熟卵母细胞的微丝分布。第二部分玻璃化冷冻对人体外成熟卵母细胞发育潜能的影响[目的]通过对比分析体外成熟卵母细胞玻璃化冷冻前后发育潜能的变化,结合第一部分拟从超微结构方面寻找玻璃化冷冻对人体外成熟卵母细胞发育潜能影响的细胞学机制。[方法]收集人未成熟(GV/M I)卵母细胞,经体外成熟为MⅡ期卵母细胞。将获得的MⅡ期卵母细胞按随机化原则分组,分为新鲜组和玻璃化冷冻组。将所有卵母细胞均行卵母细胞浆内单精子注射,观察体外成熟卵母细胞的受精数、卵裂数、优胚数及囊胚形成数。[结果]新鲜组2PN率、优质胚胎率、囊胚率、优质囊胚率分别为73.08%、23.08%、19.23%、6.73%,玻璃化冷冻组2PN率、优质胚胎率、囊胚率、优质囊胚率分别为55.16%、6.74%、9.00%、2.25%。两组之间的2PN率、优质胚胎率、囊胚率均有显著性差异(P=0.01,P<0.01,P=0.04)；优质囊胚率二者之间无显著性差异(P=0.26)。[结论]玻璃化冷冻影响了卵母细胞的发育潜能,冷冻后卵母细胞的发育潜能大大降低。