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类固醇激素的微生物降解是人们去除环境内分泌干扰物的研究热点。微生物基因组中编码降解类固醇化合物的蛋白酶的相关基因的表达调控是微生物降解类固醇激素的关键所在。其中,类固醇脱氢酶已被证实是多数生物尤其是人和动物体内类固醇激素代谢的关键酶,但目前关于类固醇脱氢酶基因及其表达调控的研究报道仍较少。为了进一步阐明类固醇脱氢酶基因及其在类固醇激素降解中的作用机制,本文以一株雌激素降解菌Rhodococcus equi DSSKP-R-001(简称R.D-001)为实验菌株,通过基因组学方法,比较类固醇脱氢酶基因在R.D-001和其他类固醇降解菌中的基因组分布特征及参与的代谢通路;通过对三种类固醇脱氢酶基因进行PCR和RT-PCR,比较其在不同类固醇底物诱导下的表达水平及代谢能力的差异性;通过生物信息学方法,比较三种类固醇脱氢酶的结构和功能,揭示其生化特征和生理作用。为今后类固醇脱氢酶基因的克隆、表达与应用探究奠定基础。本文的研究结果如下:1.R.D-001类固醇脱氢酶基因组比较研究R.D-001的基因组较为稳定,包含大量编码类固醇环降解酶的相关基因。在KEGG数据库中发现66种脱氢酶基因,占总编码基因数的1.29%。其中与类固醇激素降解相关的脱氢酶基因有19种,它们在R.D-001的基因组中具有广泛分布和相对保守的特性。其中,参与类固醇激素分解代谢途径的三种关键脱氢酶基因,分别为3-酮类固醇-?1-脱氢酶(KstD)、3-氧代-5α-类固醇4-脱氢酶1(SRD5A1)及17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSD)。三种类固醇脱氢酶基因附近存在大量保守且同源的类固醇降解基因。R.D-001基因组中包含5个KstD ORFs(3个KstD1、1个KstD2和1个KstD3),其中KstD3 ORF位于编码参与类固醇分解代谢的高度保守的基因组区域中。三种类固醇脱氢酶均参与类固醇激素合成和降解的代谢通路,进一步说明了它们在类固醇激素代谢中的重要作用。2.R.D-001类固醇脱氢酶对类固醇降解作用比较研究R.D-001可以在以雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、睾酮(TTR)及孕酮(PGT)为唯一碳源和能源的培养基中生长,同时对四种类固醇激素均具有很强的代谢能力。PGT和TTR在12 h降解率基本已达到98%以上,而E2和E3在96 h的降解率达到80%左右,菌株对PGT和TTR降解能力大于E2和E3。在四种类固醇底物的诱导下,三种脱氢酶基因均进行了表达,但在不同类固醇底物的诱导下,三种类固醇脱氢酶基因受底物特异性的影响,相对表达水平有所差异,其在降解不同类固醇底物时可能会表现出不同的选择偏好。3.R.D-001三种类固醇脱氢酶结构与功能比较研究R.D-001三种类固醇脱氢酶均具有较强的氨基酸序列同一性。001952基因编码的3-酮类固醇-Δ1-脱氢酶(KstD),包含FAD结合结构域,推测其催化活性位点内的氨基酸残基可能为Tyr104和Tyr121;005108基因编码的17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSD),包含NADH结合区域和活性位点,推测其活性位点内的催化残基可能为Tyr149和Ser150;000996基因编码的3-氧代-5α-类固醇4-脱氢酶1(SRD5A1)活性位点暂时无法预测。KstD和17β-HSD无信号肽和跨膜区,属于重要的胞内氧化还原酶,而SRD5A1有信号肽和6个跨膜区,属于跨膜蛋白。三种酶有4个蛋白激酶的磷酸化位点,活性位点内的氨基酸残基和磷酸化位点残基可能会影响酶的活性,进而影响酶对不同类固醇底物的选择偏好。总之,本研究通过对R.D-001基因组测序结果进行深入分析,充分运用比较基因组学手段阐释了类固醇脱氢酶的基因特征、表达产物及其生理作用。研究结果将有助于推进类固醇脱氢酶的分子机制与功能调控机理研究,为构建高效环境雌激素降解工程菌株提供理论基础。