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表观遗传修饰指的是,在不改变DNA序列的前提下,生物体表型发生的可遗传性变化,在干细胞的干性维持和定向分化中发挥着重要的功能。DNA甲基化可以诱导基因沉默,是表观遗传修饰的一种重要形式。研究发现,TET(ten-eleven translocation)家族蛋白可以催化DNA的5-甲基胞嘧啶(5mC)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),这种改变使基因的CpG岛(CpG islands,CGIs)去甲基化,从而诱导基因的转录激活。核孔复合体(nuclear pore complex,NPC)控制着真核细胞中细胞核与细胞质之间的物质交换,小分子,如离子和不超过50KDa的蛋白质可以通过被动扩散经由NPC进入细胞核中;而大蛋白则只能通过主动运输的方式进入细胞核发挥其生理功能。这种主动运输的蛋白质必须至少包含一个核定位信号(nuclear localization signal,NLS)。核定位信号分为经典核定位信号(classical NLS,cNLS),内输蛋白β2识别的NLS(PY-NLS)和其它类型的NLS,它们对应不同的核输入机制。参与cNLS核蛋白转运的核转运蛋白是内输蛋白α和β1,而参与PY-NLS的核转运蛋白是内输蛋白β2。TET1是定位在细胞核中的转录因子,是由2039个氨基酸组成的DNA去甲基化酶。根据在线软件POSORT II预测,TET1具有18个NLSs,其中13个单分型NLSs和5个双分型NLSs。本研究通过一系列的TET1突变体融合绿色荧光蛋白载体构建以及细胞免疫荧光染色,鉴定出了小鼠TET1蛋白中的两个功能性核定位信号KKRK和RKR R,分别位于TET1蛋白序列的603-606AA和1720-1723AA,可共同促进TET1蛋白转运至细胞核中发挥功能。本研究的主要实验结果包括:1.以小鼠胚胎干细胞J1(J1 mESCs)总RNA为模板扩增小鼠Tet1基因编码区,并构建真核表达载体pCMV-HA-TET1。Western blot以及细胞免疫荧光染色表明TET1融合蛋白可以正常表达且TET1蛋白主要定位于细胞核中,这提示了TET1至少具有一个功能性的NLS。2.研究NLS的第一步,是对TET1蛋白的序列进行分析。在线软件POSORT II(http://psort.hgc.jp/form.html)对NLS的预测表明TET1具有18个潜在性cNLSs。为了定位NLS,将TET1蛋白“切割”成5个截短突变体,并将其与示踪分子EGFP融合表达,所有融合表达的蛋白大小均超过50kDa,仅能通过主动运输的方式进入细胞核中。实验发现融合蛋白EGFP-TET1-275-862和EGFP-TET1-1463-1885主要定位于细胞核中,这提示功能性NLS存在于这两个片段中。3.通过一系列的截短实验和突变实验鉴定了功能性核定位信号603KKRK606和1720R KRR1723,其中KKRK位于TET1蛋白N端的CXXC区域,而RKRR位于C端的催化结构域中。生物信息学软件比对了小鼠、大鼠、人、豚尾猴、土拨鼠、牛和野猪的TE T1蛋白序列,结果显示核定位信号KKRK在这些物种间高度保守,而RKRR并不保守。TET蛋白家族的同源性分析则表明KKRK和RKRR均不保守。综上所述,本研究成功构建了小鼠pCMV-HA-TET1真核表达载体;鉴定出了小鼠TET1的两个功能性NLS,其中KKRK位于TET1蛋白N端的CXXC区域,而RKRR位于C端的催化结构域中;TET1的核定位信号KKRK高度保守而RKRR并不保守。这对于进一步的研究TET1的功能以及揭示TET1的核转运机制有很大帮助。