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目的:本研究以多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226为研究对象,从两个方面观察CPT和马法兰（Melphalan,Mel）单药及联合用药后对细胞增殖的影响:第一,分析CPT和Mel单药及联合用药对RPMI8226细胞的细胞毒性作用;第二,对两药联合作用于RPMI8226细胞后凋亡通路上的相关基因进行检测。通过该研究期望为CPT在多发性骨髓瘤患者（multiple myeloma,MM）临床治疗上扩展新的治疗方案,以提高MM患者的预后。方法:1.人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226的培养和传代人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226培养与含体积分数为10%的灭活胎牛血清（FBS）、100U/ml的青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的的RPMI8226培养液中,置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养,每2-3天传代一次,待细胞处于对数生长期时进行后续实验。2.CCK-8法检测CPT和Mel单药对RPMI8226细胞抑制率的影响取对数生长期的RPMI8226细胞,调整细胞密度为1.5×104/ml,接种于96孔培养板中,分别加入7种不同终浓度的CPT（500ng/ml、125ng/ml、31.25 ng/ml、7.8125ng/ml、1.9531ng/ml、0.4883ng/ml、0.1221ng/ml）,7种不同终浓度Mel（37.5μg/ml、28.125μg/ml、21.0938μg/ml、15.8203μg/ml、11.8652μg/ml、8.8989μg/ml、6.6742μg/ml）,培养不同时间24h和48h,培养结束前4h加入10μl CCK-8试剂,置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养4h,培养结束后上酶标仪测OD值,绘制细胞生长曲线,计算细胞抑制率。每组实验重复3次,取均数和标准差进行统计分析。3.CCK-8法检测CPT+Mel对RPMI8226细胞抑制率的影响取对数生长期的RPMI8226细胞,调整细胞密度为1.5×104/ml,接种于96孔培养板中。取抑制率为1/2 IC50和IC50的CPT终浓度分别与Mel7个浓度梯度联合培养24h和48h,计算细胞抑制率。取抑制率为1/2 IC50和IC50的Mel终浓度分别与CPT 7个浓度梯度联合培养24h和48h,计算细胞抑制率。培养结束前4h加入10μl CCK-8试剂,置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养4h,培养结束后上酶标仪测OD值,绘制细胞生长曲线,计算细胞存活率。每组实验重复3次,取均数和标准差进行统计分析。4.选择最佳联合用药方案选择抑制率为1/2 IC50和IC50的CPT浓度与Mel的7个浓度梯度联合作用于RPMI8226细胞24h和48h,计算联合用药后的细胞抑制率。选择抑制率为1/2 IC50和IC50的Mel浓度与CPT的7个浓度梯度联合作用于RPMI8226细胞24h和48h,计算联合用药后的细胞抑制率。计算结果用Compusyn软件评价联合用药对RPMI8226细胞的抑制率与联合用药指数（combination index,CI）的关系,判断药物间的相互作用:CI<1,判定为2药具有协同作用;CI=1,判定为2药具有叠加作用;CI>1,则2药具有拮抗作用。5.流式细胞术检测CPT+Mel对RPMI8226细胞凋亡率的影响根据Compusyn软件计算结果取CI最小时的CPT浓度和Mel浓度进行细胞凋亡率和坏死率的检测。取对数生长期RPMI8226细胞,调整细胞密度为1×106/ml,接种于24孔培养板中,设置空白对照组、CPT单药组、Mel单药组、CPT+Mel组,放置在37℃,5%CO2的培养箱内培养0、2、4、6h。培养完成后,收集各组细胞,并使用PBS离心洗涤后弃掉上清,并加入10μl Annexin V-FITC结合液和10μl PI染色液并混匀。室温下避光放置15 min,上流式细胞仪检测。每组实验重复3次,取均数和标准差进行统计分析。6.实时荧光定量PCR（Realtime quantitative-PCR,RQ-PCR）方法检测CPT和Mel单药及联合用药对RPMI8226细胞凋亡通路相关基因表达的影响取CI最小时的CPT浓度和Mel浓度对细胞凋亡通路上的相关基因进行检测。取对数生长期RPMI8226细胞,调整细胞密度为1×106/ml,接种于24孔培养板中,设置空白对照组、CPT单药组、Mel单药组、CPT+Mel组,放置在37℃,5%CO2的培养箱内培养2、4、6h。培养完成后应用TRIzol法提取总RNA,采用M-Mu Lv（TaKaRa）逆转录酶获得cDNA。逆转录反应条件:95℃预变性2min,94℃变性30S,58℃退火30S,72℃延伸30S,循环35次,72℃再延伸10min。实时荧光定量PCR的反应体系:cDNA（10×稀释）2μl,上游引物（20μmol/L）0.8μl,下游引物（20μmol/L）0.8μl,SYBR Premix Ex Taq TMⅡ10μl,ddH2O 6μl,ROXⅡ0.4μl。反应条件:95℃预变性10min,95℃变性15S,60℃退火60S,循环35次,72℃再延伸10min。绘制溶解曲线,最终数据以2-ΔΔCT进行分析。每组实验重复3次,取均数和标准差进行统计分析。结果:1.细胞增殖实验结果显示,CPT以时间-剂量依赖方式抑制RPMI8226细胞的增殖,CPT单药作用时7个浓度间抑制率的比较差异有统计学意义（P<0.001）、相同浓度间24h和48h抑制率的比较差异有统计学意义（P<0.001）。CPT单药处理R PMI8226细胞24h和48h的半数抑制浓度（IC50）分别为4.839 ng/ml和2.606 ng/ml,24h时1/2 IC50为2.42 ng/ml。Mel以时间-剂量依赖方式抑制RPMI8226细胞的增殖,Mel单药作用时7个浓度间抑制率的比较差异有统计学意义（P<0.001）、相同浓度间24h和48h抑制率的比较差异有统计学意义（P<0.001）。Mel单药处理RPMI8226细胞24h和48h的IC50分别为12.877μg/ml和10.026μg/ml,24h时1/2IC50为6.4385μg/ml。2.细胞增殖实验结果显示,当CPT以1/2 IC50和IC50（2.42 ng/ml、4.839 n g/ml）分别与Mel的7个浓度联合处理RPMI8226细胞,联合用药组抑制率比Mel单药组抑制率明显增高,差异有统计学意义（P<0.001）。Mel以1/2 IC50和IC50（6.4385μg/ml、12.877μg/ml）分别与CPT的不同浓度梯度联合处理RPMI8226细胞,联合用药组与CPT单药组比较抑制率明显增高,差异有统计学意义（P<0.001）。3.经CompuSyn软件分析联合用药指数,结果表明,6.4385μg/ml和12.877μg/ml的Mel同31.25 ng/ml以下的各浓度CPT联合作用时,CI值均小于1,且联合用药组凋亡率较单药组相比抑制率更高,差异有统计学意义（P<0.05）。当2.42ng/ml和4.839ng/ml的CPT同21.09μg/ml以下的各浓度Mel联合作用时,CI值均小于1,且联合用药组凋亡率较单药组相比抑制率更高,差异有统计学意义（P<0.05）。4.839 ng/ml的CPT联合6.4385μg/ml的Mel时CI值最小（CI=0.472）,抑制率分别由单药处理时的50%和20%提高至65.95%。总地来说,两药在较低浓度联合使用时,协同效应更强,即使在低浓度下联合使用,其抑制率也均较单药处理组高。4.选择CI最低的两药浓度（CPT 4.839 ng/ml和Mel 6.6742μg/ml）,进行细胞凋亡率和坏死率检测。结果显示;同单一用药组相比,联合用药组Annexin-v+/PI-和Annexin-v+/PI+的阳性率随着药物作用时间的延长均逐渐上升,且均高于单药处理组,Annexin-v-/PI+的阳性率基本不变。对照组、Mel单药组、CPT单药组、CPT+Mel组0h凋亡率分别为（2.0±1.45）%、（6.7±2.13）%、（22.2±2.04）%、（19.4±1.23）%,坏死率分别为（1.8±1.69）%、（1.7±2.08）%、（2.3±1.35）%、（2.3±2.47）%。对照组、Mel单药组、CPT单药组、CPT+Mel组2 h凋亡率分别为（4.2±2.32）%、（20.1±1.31）%、（23.4±1.68）%、（21.6±2.34）%,坏死率分别为（4.0±1.49）%、（2.2±2.39）%、（3.4±1.93）%、（2.3±1.93）%。对照组、CPT单药组、Mel单药组、CPT+Mel组4 h凋亡率分别为（6.7±1.23）%、（22.5±2.41）%、（28.2±3.31）%、（32.5±3.17）%,坏死率分别为（1.7±0.97）%、（2.0±2.15）%、（2.8±1.37）%、（4.0±1.15）%。对照组、CPT单药组、Mel单药组、CPT+Mel组6 h凋亡率分别为（20.1±1.72）%、（28.2±2.05）%、（37.4±1.35）%、（48.6±1.55）%,坏死率分别为（2.2±1.97）%、（1.6±1.89）%、（5.4±1.14）%、（6.6±1.02）%。联合用药组凋亡率分别与单药组相比,6h凋亡率差异有统计学意义（P<0.001）。联合用药组坏死率分别与单药组相比,6h坏死率差异无统计学意义（P>0.05）。5.选择CI最低时的两药浓度（CPT 4.839 ng/ml和Mel 6.6742μg/ml）,利用RQ-PCR法检测单药处理后及两药联合后凋亡通路上相关基因的表达。结果表明,CPT可使细胞内DR4、DR5、Bax基因的表达增强,同时下调Mcl-1基因的表达;Mel可使细胞内P53、DR5和Bim基因的表达增强,同时抑制Bcl-2和Mcl-1基因的表达。两药联合作用6h后P53、DR4、DR5、Bim和Bax基因的相对表达量较单药组相比显著增高,同时Bcl-2和Mcl-1基因的相对表达较单药组相比显著降低。结论:1.CPT+Mel作用于RPMI8226细胞,低浓度下为协同效应。2.CPT+Mel抑制RPMI8226细胞增殖的主要方式为促进细胞凋亡。3.CPT+Mel抑制RPMI8226细胞增殖的作用机制是协同下调Mcl-1、Bcl-2等抗凋亡基因的表达,上调DR4、DR5、Bim、Bax等促凋亡基因和P53基因的表达。